Lajme

Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Metodat enzimatike të etiketimit të afërsisë bazuar në esteret e aktivizuara ose radikalet fenoksi përdoren gjerësisht për të hartuar proteomet nënqelizore dhe ndërvepruesit e proteinave në qelizat e gjalla.Megjithatë, esteret e aktivizuar janë më pak reaktivë, duke rezultuar në një rreze të gjerë etiketimi, dhe radikalet fenoksi të krijuara nga trajtimi me peroksid mund të ndërhyjnë në rrugët redoks.Këtu ne raportojmë një metodë të fotoaktivizimit të varur të etiketimit të afërsisë (PDPL) e zhvilluar duke lidhur gjenetikisht proteinën fotosensibilizuese miniSOG me një proteinë me interes.I nxitur nga drita blu dhe i kontrolluar nga koha e ekspozimit, gjenerohet oksigjen i vetëm dhe më pas arrihet etiketimi i zgjidhshëm hapësinor i mbetjeve të histidinës nga sonda e anilinës.Ne demonstrojmë besnikërinë e tij të lartë përmes hartës së proteomeve specifike të organelave.Një krahasim krah për krah i PDPL me TurboID tregon një mbulim proteomik më specifik dhe gjithëpërfshirës të PDPL.Më pas, ne aplikuam PDPL në koaktivizuesin transkriptues të lidhur me sëmundjen BRD4 dhe ligazën E3 Parkin dhe gjetëm ndërveprues të panjohur më parë.Nga shqyrtimi i mbishprehjes, dy substrate të panjohura, Ssu72 dhe SNW1, u identifikuan për Parkin, degradimi i të cilit ndërmjetësohet nga rruga ubiquitinim-proteazomë.
Karakterizimi i saktë i rrjeteve proteinike qëndron në themel të shumë proceseve themelore qelizore.Prandaj, hartëzimi hapësinor shumë i saktë i ndërveprimeve të proteinave do të sigurojë një bazë molekulare për deshifrimin e rrugëve biologjike, patologjinë e sëmundjes dhe ndërprerjen e këtyre ndërveprimeve për qëllime terapeutike.Për këtë qëllim, metodat e afta për të zbuluar ndërveprimet kohore në qelizat ose indet e gjalla janë shumë të dëshirueshme.Spektrometria e masës së pastrimit të afinitetit (AP-MS) është përdorur historikisht për të identifikuar partnerët lidhës të proteinave me interes (POI).Me zhvillimin e metodave sasiore të proteomikës, u krijua Bioplex3.0, databaza më e madhe e rrjeteve proteinike të bazuara në AP-MS.Megjithëse AP-MS është shumë i fuqishëm, hapat e lizës dhe hollimit të qelizave në rrjedhën e punës janë të njëanshme drejt ndërveprimeve lidhëse të dobëta dhe kalimtare dhe prezantojnë artefakte pas lizës, si çifte ndërveprimi të rremë që nuk kanë ndarje para lizës.
Për të adresuar këto çështje, janë zhvilluar aminoacide të panatyrshme (UAA) me grupe ndërlidhëse dhe platforma enzimatike të etiketimit (PL) (p.sh. APEX dhe BioID)5.Edhe pse metoda UAA është aplikuar me sukses në shumë skenarë dhe ofron informacion mbi ngjitësit direkt të proteinave, ende kërkohet optimizimi i vendit të futjes së UAA.Më e rëndësishmja, është një metodë etiketimi stoikiometrike që i mungon një ndryshim katalitik i ngjarjeve të etiketimit.Në të kundërt, metodat enzimatike PL, të tilla si metoda BioID, bashkojnë ligazën e inxhinieruar të biotinës me POI7, e cila më pas aktivizon biotinën për të formuar një ndërmjetës reaktiv ester biotinil-AMP.Kështu, enzima katalizon dhe lëshon një "re" të aktivizuar të biotinës që etiketon mbetjet proksimale të lizinës.Megjithatë, BioID kërkon më shumë se 12 orë për të marrë një sinjal të mjaftueshëm të etiketuar, i cili përjashton përdorimin e tij me rezolucion të përkohshëm.Duke përdorur evolucionin e drejtuar bazuar në shfaqjen e majave, TurboID u projektua bazuar në BioID për të qenë më efikas, duke lejuar etiketim efikas me biotinë brenda 10 minutave, duke lejuar që të studiohen procese më dinamike.Për shkak se TurboID është shumë aktiv dhe nivelet endogjene të biotinës janë të mjaftueshme për etiketimin e nivelit të ulët, etiketimi i sfondit bëhet një problem i mundshëm kur kërkohet etiketim shumë i zgjeruar dhe në kohë nga shtimi i biotinës ekzogjene.Përveç kësaj, esteret e aktivizuar janë dobët reaktivë (t1/2 ~ 5 min), gjë që mund të çojë në një rreze të madhe etiketimi, veçanërisht pas ngopjes së proteinave fqinje me biotinë 5. Në një qasje tjetër, shkrirja gjenetike e askorbate peroksidazës së inxhinieruar (dmth. biotin- radikalët e fenolit dhe lejon etiketimin e proteinave brenda një minute9,10. APEX përdoret gjerësisht për të identifikuar proteomet nënqelizore, komplekset e proteinave të membranës dhe komplekset e proteinave sinjalizuese citozolitike11,12. Megjithatë, nevoja për përqendrime të larta të peroksideve mund të ndikojë në proteinat redoks ose rrugët, duke ndërprerë proceset qelizore.
Kështu, një metodë e re e aftë për të gjeneruar specie më reaktive të shtypjes së etiketuar me rreze me saktësi të lartë hapësinore dhe kohore pa ndërprerë ndjeshëm rrugët qelizore do të jetë një shtesë e rëndësishme për metodat ekzistuese. Midis specieve reaktive, oksigjeni i vetëm zgjoi vëmendjen tonë për shkak të jetëgjatësisë së tij të shkurtër dhe rrezes së kufizuar të difuzionit (t1/2 < 0,6 µs në qeliza)13. Midis specieve reaktive, oksigjeni i vetëm zgjoi vëmendjen tonë për shkak të jetëgjatësisë së tij të shkurtër dhe rrezes së kufizuar të difuzionit (t1/2 < 0,6 µs në qeliza)13. Mesaktivi form наше внимание привлек синглетный жител из-за его короткого времени жизни и радиуса të kufizuara diffusione (t1/2 < 0,6 mx в клетках)13. Ndër format aktive, oksigjeni i vetëm tërhoqi vëmendjen tonë për shkak të jetëgjatësisë së tij të shkurtër dhe rrezes së kufizuar të difuzionit (t1/2 < 0,6 µs në qeliza)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中有限（细径有限（细径有限（细径有限（细胞中摑t1/2、中摏瀻而耆而1５ 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Formulari i aktiviteve наше внимание привлекает синглетный за его короткого времени жизни и diffuzione të kufizuara (t1/2 < 0,6 мкс во клетках). Midis formave aktive, oksigjeni i vetëm tërheq vëmendjen tonë për shkak të jetëgjatësisë së tij të shkurtër dhe rrezes së kufizuar të difuzionit (t1/2 < 0,6 μs në qeliza).Oksigjeni i vetëm është raportuar se oksidon rastësisht metioninën, tirozinën, histidinën dhe triptofanin, duke e bërë atë polare 14,15 për lidhjen me sondat me bazë amine ose tiol16,17.Megjithëse oksigjeni i vetëm është përdorur për të etiketuar ARN-në e ndarjes nënqelizore, strategjitë për ripërdorimin e shënuesve të afërsisë endogjene të POI mbeten të paeksploruara.Këtu, ne paraqesim një platformë të quajtur etiketimi i afërsisë së varur nga fotoaktivizimi (PDPL), ku përdorim dritën blu për të ndriçuar POI-të e shkrirë me një fotosensibilizues miniSOG dhe për të shkaktuar gjenerimin e oksigjenit të vetëm për të oksiduar mbetjet proksimale, e ndjekur nga modifikimet që përmbajnë aminë për të oksiduar sondat kimike në qelizat e gjalla të ndërmjetme..Ne testuam një grup sondash kimike për të maksimizuar specifikën e etiketave dhe identifikuam faqet e modifikimit duke përdorur një rrjedhë pune të hapur të proteomikës.Një krahasim krah për krah i PDPL me TurboID tregon një mbulim proteomik më specifik dhe gjithëpërfshirës të PDPL.Ne aplikuam këtë qasje për shënuesit specifikë të organeleve të proteomës nënqelizore dhe identifikimin e përgjithshëm të proteomeve të partnerëve lidhës për proteinën rregulluese epigjenetike BRD4 të lidhur me kancerin dhe ligazën E3 Parkin të lidhur me sëmundjen e Parkinsonit, të cilat konfirmuan një rrjet të njohur dhe të panjohur të proteinave. ndërveprimet..Aftësia e PDPL për të njohur substratet E3 në komplekset e mëdha proteinike përfaqëson një situatë ku kërkohet njohja e lidhësve indirekt.Dy substrate të panjohura parkine të ndërmjetësuara nga ubiquitinimi-proteazomë janë konfirmuar in situ.
Terapia fotodinamike (PDT)19 dhe inaktivizimi me lazer me ndihmën e kromoforit (CALI)20, në të cilin rrezatimi i dritës me fotosensibilizues gjeneron oksigjen të vetëm, mund të çaktivizojë proteinat e synuara ose të shkaktojë vdekjen e qelizave.Meqenëse oksigjeni i vetëm është një substancë shumë reaktive me një distancë teorike të difuzionit prej rreth 70 nm, oksidimi i kufizuar hapësinor rreth fotosensibilizuesit mund të kontrollohet.Bazuar në këtë koncept, ne vendosëm të përdorim oksigjen të vetëm për të arritur etiketim të ngushtë të komplekseve proteinike në qelizat e gjalla.Ne kemi zhvilluar një qasje kemoproteomike PDPL për të përmbushur katër funksione: (1) për të katalizuar gjenerimin e oksigjenit të vetëm aktiv të ngjashëm me qasjen enzimatike PL;(2) të sigurojë etiketim të zgjidhur në kohë pas fillimit të dritës;(3) me ndryshim (4) Shmangni përdorimin e kofaktorëve endogjenë (siç është biotina) për të reduktuar sfondin, ose përdorni reagentë ekzogjenë shumë shqetësues (të tillë si peroksidet) për të minimizuar ekspozimin e qelizave ndaj stresit mjedisor.
Fotosensibilizuesit mund të ndahen në dy kategori duke përfshirë fluoroforet me peshë të vogël molekulare (p.sh. rozë bengal, blu metilen)22 dhe proteina të vogla të koduara gjenetikisht (p.sh. miniSOG, KillerRed)23.Për të arritur një dizajn modular, ne zhvilluam platformën PDPL të gjeneratës së parë duke shtuar proteina fotosensibilizuese (PS) në POI24,25 (Figura 1a).Kur rrezatohet me dritë blu, oksigjeni i vetëm oksidon mbetjet e aminoacideve nukleofile proksimale, duke rezultuar në një polaritet umpolung që është elektrofilik dhe mund të reagojë më tej me nukleofilet e sondës amine16,17.Sonda është projektuar me një dorezë alkine për të lejuar kiminë e klikimeve dhe tërheqjen poshtë për karakterizimin LC/MS/MS.
Ilustrim skematik i etiketimit të komplekseve proteinike të ndërmjetësuara nga miniSOG.Kur ekspozohen ndaj dritës blu, qelizat që shprehin miniSOG-POI gjenerojnë oksigjen të vetëm, i cili modifikon proteinat ndërvepruese, por jo proteinat jo-lidhëse.Produktet e ndërmjetme të fotooksidimit kapen nga etiketat rele të sondës kimike të aminës për të formuar addukte kovalente.Grupi alkinil në sondën e kimisë lejon kiminë e klikimit për pasurim me tërheqje poshtë e ndjekur nga sasia LC-MS/MS.b Struktura kimike e sondave amine 1-4.c Analiza përfaqësuese e xhelit fluoreshente e shënuesve proteomikë të ndërmjetësuar nga miniSOG të lokalizuara mitokondriale duke përdorur sondat 1-4 dhe kuantifikimin relativ bazuar në densitometrinë e xhelit.Raporti sinjal ndaj sfondit të sondave kimike u vlerësua duke përdorur eksperimente të kontrollit negativ duke përjashtuar dritën blu ose duke përdorur qeliza HEK293T pa shprehje miniSOG.n = 2 mostra biologjikisht të pavarura.Çdo pikë përfaqëson një kopje biologjike.d Zbulimi përfaqësues dhe kuantifikimi i PDPL duke përdorur sondën 3 të optimizuar në prani ose mungesë të komponentëve të treguar PDPL si c.n = 3 mostra biologjikisht të pavarura.Çdo pikë përfaqëson një kopje biologjike.Vijat qendrore dhe mustaqet përfaqësojnë devijimin mesatar dhe ± standard.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Imazhe konfokale e oksigjenit të vetëm me njollë Si-DMA të kuqe të largët.Shiriti i shkallës: 10 µm.Eksperimentet e imazhit me xhel dhe konfokale u përsëritën në mënyrë të pavarur të paktën dy herë me rezultate të ngjashme.
Ne testuam fillimisht aftësinë e fotosensibilizuesve të pjekur miniSOG26 dhe KillerRed23, të shprehura në mënyrë të qëndrueshme në HEK293T, për të ndërmjetësuar etiketimin me propargjilaminë të proteomës si një sondë kimike (Fig. suplementare 1a).Analiza e fluoreshencës së xhelit tregoi se etiketimi i tërë proteomes u arrit duke përdorur miniSOG dhe rrezatim të dritës blu, ndërsa asnjë produkt i dukshëm etiketimi nuk u vu re me KillerRed.Për të përmirësuar raportin sinjal ndaj sfondit, më pas testuam një grup sondash kimike që përmbajnë aniline (1 dhe 3), propilaminë (2) ose benzilaminë (4).Ne vumë re se vetë qelizat HEK293T kishin një sinjal sfondi më të lartë në krahasim me mungesën e dritës blu, ndoshta për shkak të fotosensibilizuesit endogjen të riboflavinës, mononukleotidit flavin (FMN) 27 . Sondat kimike të bazuara në anilinë 1 dhe 3 dhanë specifikë më të mirë, me HEK293T që shpreh në mënyrë të qëndrueshme miniSOG në mitokondri duke shfaqur një rritje >8 herë në sinjal për sondën 3, ndërsa sonda 2 e përdorur në metodën e etiketimit të ARN-së CAP-seq shfaq vetëm ~2.5- Rritja e sinjalit të palosshme, me gjasë për shkak të preferencave të ndryshme të reaktivitetit midis ARN dhe proteinës (Fig. 1b, c). Sondat kimike të bazuara në anilinë 1 dhe 3 dhanë specifikë më të mirë, me HEK293T që shpreh në mënyrë të qëndrueshme miniSOG në mitokondri duke shfaqur një rritje >8 herë në sinjal për sondën 3, ndërsa sonda 2 e përdorur në metodën e etiketimit të ARN-së CAP-seq shfaq vetëm ~2.5- Rritja e sinjalit të palosshme, me gjasë për shkak të preferencave të ndryshme të reaktivitetit midis ARN dhe proteinës (Fig. 1b, c).Sondat kimike të bazuara në anilinë 1 dhe 3 treguan specifikë më të mirë: HEK293T, i cili shpreh në mënyrë të qëndrueshme miniSOG në mitokondri, tregon më shumë se 8-fish rritje të sinjalit për sondën 3, ndërsa sonda 2, e përdorur në metodën e etiketimit të ARN-së CAP-seq, vetëm tregon ~ 2.5-fish rritje të sinjalit, ndoshta për shkak të preferencave të ndryshme të reaktivitetit midis ARN dhe proteinës (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 表达 探针 探针 探针 探针 的 信号 增加> 8 倍 用 用 于 于 标记 标记 方法 方法 方法 方法 的 的 2 显示 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2 2.5-倍信号增加，可能是由于ARN 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 ， 探针 探针 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于ARNSondat kimike të bazuara në anilinë 1 dhe 3 kishin specifikë më të mirë, HEK293T shprehte në mënyrë të qëndrueshme miniSOG në mitokondri dhe sonda 3 kishte mbi 8-fish rritje të sinjalit, ndërsa sonda 2 për metodën e etiketimit të ARN-së CAP-seq tregoi vetëm ~ 2.5-fish rritje.në sinjal, ndoshta për shkak të preferencave të ndryshme të reagimit midis ARN dhe proteinës (Fig. 1b, c).Përveç kësaj, u testuan izomerët e sondës 3 dhe sondat e hidrazinës (sonda 5, 6, 7), duke konfirmuar optimizimin e sondës 3 (Figura plotësuese 1b,c).Në mënyrë të ngjashme, analiza e fluoreshencës në xhel zbuloi parametra të tjerë eksperimentalë të optimizuar: gjatësinë e valës së rrezatimit (460 nm), përqendrimin e sondës kimike (1 mM) dhe kohën e rrezatimit (20 min) (Figura suplementare 2a-c).Mospërfshirja e ndonjë komponenti ose hapi në protokollin PDPL rezultoi në një ndryshim domethënës të sinjalit në sfond (Fig. 1d).Veçanërisht, etiketimi i proteinave u reduktua ndjeshëm në prani të azidit të natriumit ose trolox, të cilat dihet se shuajnë oksigjenin e vetëm.Prania e D2O, e cila dihet se stabilizon oksigjenin e vetëm, rrit sinjalin e etiketimit.Për të hetuar kontributin e specieve të tjera reaktive të oksigjenit në etiketim, manitoli dhe vitamina C u shtuan për të krijuar pastruesit e radikalëve hidroksil dhe superoksid, respektivisht, 18, 29, por nuk u gjetën të reduktonin etiketimin.Shtimi i H2O2, por jo ndriçimi, nuk rezultoi në etiketim (Figura plotësuese 3a).Imazhi i oksigjenit me fluoreshencë me sonda Si-DMA konfirmoi praninë e oksigjenit të vetëm në telin HEK293T-miniSOG, por jo në telin origjinal HEK293T.Përveç kësaj, mitoSOX Red nuk mund të zbulojë prodhimin e superoksidit pas ndriçimit (Fig. 1e dhe Fig. 3b plotësues) 30. Këto të dhëna sugjerojnë fuqimisht se oksigjeni i vetëm është specia kryesore reaktive e oksigjenit përgjegjës për etiketimin e mëvonshëm proteomik.Citotoksiciteti i PDPL u vlerësua duke përfshirë rrezatimin e dritës blu dhe sondat kimike, dhe nuk u vu re asnjë citotoksicitet domethënës (Fig. suplementare 4a).
Për të studiuar mekanizmin e etiketimit dhe për të mundësuar identifikimin proteomik të komplekseve proteinike duke përdorur LC-MS/MS, së pari duhet të përcaktojmë se cilat aminoacide janë modifikuar dhe masën delta të etiketimeve të sondës.Metionina, histidina, triptofani dhe tirozina janë raportuar të modifikohen nga oksigjeni i vetëm14,15.Ne integrojmë rrjedhën e punës TOP-ABPP31 me kërkimin e hapur të paanshëm të ofruar nga platforma informatike FragPipe bazuar në MSFragger32.Pas modifikimit të oksigjenit të vetëm dhe etiketimit të sondës kimike, kimia e klikimit u krye duke përdorur një etiketë reduktuese të biotinës që përmban një lidhës të këputshëm, e ndjekur nga shtrirja e neutravidinës dhe tretja e tripsinës.Peptidi i modifikuar, ende i lidhur me rrëshirën, u fotokëput për analizën LC-MS/MS (Figura 2a dhe të dhënat Suplementare 1).Një numër i madh modifikimesh ndodhën në të gjithë proteomën me mbi 50 përputhje të hartës peptide (PSM) të listuara (Fig. 2b).Çuditërisht, ne vumë re vetëm modifikimin e histidinës, ndoshta për shkak të reaktivitetit më të lartë të histidinës së oksiduar ndaj sondave të anilinës sesa aminoacidet e tjera.Sipas mekanizmit të publikuar të oksidimit të histidinës nga oksigjeni i vetëm, 21,33, struktura e propozuar me masë delta prej +229 Da korrespondon me adduktin e sondës 3 me 2-okso-histidinën pas dy oksidimeve, ndërsa +247 Da është produkti i hidrolizës. prej +229 Da (Fig. Suplementare 5).Vlerësimi i spektrit MS2 tregoi një besueshmëri të lartë të identifikimit të shumicës së joneve y dhe b, duke përfshirë identifikimin e joneve të modifikuara të fragmentit (y dhe b) (Fig. 2c).Analiza e kontekstit të sekuencës lokale të histidinave të modifikuara me PDPL zbuloi një preferencë të moderuar të motivit për mbetjet e vogla hidrofobike në pozicione ±1 (Figura plotësuese 4b).Mesatarisht, 1.4 histidina u identifikuan për proteinë dhe vendet e këtyre shënuesve u përcaktuan nga zona e sipërfaqes së aksesueshme me tretës (SASA) dhe analiza e disponueshmërisë relative të tretësit (RSA) (Figura plotësuese 4c,d).
Një rrjedhë pune e paanshme për studimin e selektivitetit të mbetur duke përdorur platformën informatike FragPipe të mundësuar nga MSFragger.Lidhës të shkëputshëm përdoren në kiminë Click për të lejuar fotokëputjen e peptideve të modifikuara nga rrëshira e streptavidinës.U nis një kërkim i hapur për të identifikuar modifikime të shumta, si dhe mbetje përkatëse.b Cakto masën e modifikimeve që ndodhin në të gjithë proteomën.Harta e peptideve PSM.c Shënim spektral MS2 i vendeve të histidinës të modifikuara me sondën 3. Si shembull përfaqësues, një reaksion kovalent me sondën 3 i shtoi +229,0938 Da aminoacidit të modifikuar.d Analiza e mutacionit e përdorur për të testuar për shënuesit PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) dhe PRDX1 (H10A, H81A, H169A) u transfektuan me plazmide të tipit të egër për zbulimin kundër Flamurit.e Peptidi sintetik u reagua me miniSOG të pastruar në prani të sondës 3 dhe produktet përkatëse me Δm +247 dhe +229 u vunë re në spektrin LC-MS.f Ndërveprimet in vitro proteinë-proteinë të modeluara me miniSOG-6xHis-etiketë dhe antitrupa anti-6xHis.Antibiotina (streptavidin-HRP) dhe analiza Western blot kundër miut të komplekseve të antitrupave miniSOG-6xHis/anti-6xHis të etiketuara me sondën 3, në varësi të kohës së ekspozimit ndaj dritës.Etiketat për proteinat individuale shprehen në peshën molekulare përkatëse: zinxhiri i lehtë i antitrupave LC, zinxhiri i rëndë i antitrupave HC.Këto eksperimente u përsëritën në mënyrë të pavarur të paktën dy herë me rezultate të ngjashme.
Për verifikimin biokimik të vendit të etiketimit, PRDX3 dhe PRDX1 të identifikuara me spektrometrinë e masës u ndryshuan nga histidina në alaninë dhe u krahasuan me llojin e egër në analizat e transfektimit.Rezultatet e PDPL treguan se mutacioni uli ndjeshëm etiketimin (Fig. 2d).Ndërkohë, sekuencat e peptideve të identifikuara në kërkimin e hapur u sintetizuan dhe reaguan in vitro me miniSOG të pastruar në prani të sondës 3 dhe dritës blu, duke dhënë produkte me një zhvendosje masive prej +247 dhe +229 Da kur u zbuluan nga LC-MS (Fig. 2e).).Për të testuar nëse proteinat proksimale ndërvepruese mund të etiketohen in vitro në përgjigje të fotoaktivizimit të miniSOG, ne projektuam një analizë artificiale të afërsisë nga ndërveprimi midis proteinës miniSOG-6xHis dhe një antitrupi monoklonal anti-His in vitro (Figura 2f).Në këtë analizë, ne prisnim etiketimin proksimal të zinxhirëve të rëndë dhe të lehtë të antitrupave me miniSOG.Në fakt, anti-miu (duke njohur zinxhirët e rëndë dhe të lehtë të antitrupave të etiketuar me anti-6xHis) dhe streptavidin blots Western treguan biotinilim të fortë të zinxhirit të rëndë dhe të lehtë.Veçanërisht, ne vumë re autobiotinilimin e miniSOG për shkak të etiketës 6xHis dhe lidhjeve të kryqëzuara midis zinxhirëve të lehtë dhe të rëndë, të cilat mund të lidhen me hendekun e përshkruar më parë midis përgjigjes proksimale të lizinës dhe 2-okso-histidinës.Si përfundim, konkludojmë se PDPL modifikon histidinën në një mënyrë të varur nga afërsia.
Qëllimi ynë tjetër ishte të karakterizonim proteomën nënqelizore për të testuar specifikën e etiketimit in situ.Prandaj, ne shprehëm në mënyrë të qëndrueshme miniSOG në bërthamën, matricën mitokondriale ose membranën e jashtme ER të qelizave HEK293T (Fig. 3a).Analiza e fluoreshencës me xhel zbuloi breza të bollshëm të etiketuar në tre vendndodhje nënqelizore si dhe modele të ndryshme etiketimi (Fig. 3b).Analiza imazherike me fluoreshencë tregoi specifikë të lartë të PDPL (Fig. 3c).Rrjedha e punës PDPL u pasua nga reaksione klikimi me ngjyra rodamine për të përcaktuar proteomet nënqelizore duke përdorur mikroskopin fluoreshent dhe sinjalet PDPL u kolokalizuan me DAPI, gjurmues mitokondrial ose gjurmues ER, duke konfirmuar besnikërinë e lartë të PDPL.Për të tre vendndodhjet e organelave, një krahasim krah për krah i PDPL me TurboID duke përdorur avidin western blot tregoi se PDPL ishte etiketuar në mënyrë më specifike në krahasim me kontrollet e tyre përkatëse.Në kushtet e PDPL, u shfaqën më shumë breza të etiketuar, duke treguar më shumë proteina të etiketuara me PDPL (Figura suplementare 6a-d).
një paraqitje skematike e etiketimit të proteomeve specifike të organeleve të ndërmjetësuara nga miniSOG.miniSOG synon matricën mitokondriale nëpërmjet shkrirjes me aminoacidet N-terminale 23 të COX4 të njeriut (mito-miniSOG), bërthamën përmes bashkimit me H2B (bërthamë-miniSOG) dhe Sec61β nëpërmjet anës citoplazmike të membranës ER (ER-miniSOG ).Indikacionet përfshijnë imazhe me xhel, imazhe konfokale dhe spektrometrinë e masës.b Imazhe përfaqësuese të xhelit të tre profileve PDPL specifike të organelave.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Imazhe përfaqësuese konfokale të qelizave HEK293T që shprehin në mënyrë të qëndrueshme miniSOG me lokalizime të ndryshme nënqelizore të zbuluara nga antitrupat e etiketuar V5 (e kuqe).Markuesit nënqelizor përdoren për mitokondri dhe ER (jeshile).Rrjedha e punës PDPL përfshin zbulimin e proteomeve nënqelizore të etiketuara miniSOG (të verdhë) duke përdorur kiminë e klikimit të Cy3-azidit.Shiriti i shkallës: 10 µm.d Komplote vullkanike të proteomeve të etiketuara me PDPL në organele të ndryshme të përcaktuara nga sasia e paetiketuar (n = 3 eksperimente biologjike të pavarura).T-testi studentor me dy bishta u përdor në parcelat e vullkanit.Lloji i egër HEK293T u përdor si kontroll negativ. Proteinat e ndryshuara dukshëm janë të theksuara me të kuqe (p <0.05 dhe >2-fish diferenca e intensitetit të joneve). Proteinat e ndryshuara dukshëm janë të theksuara me të kuqe (p <0.05 dhe >2-fish diferenca e intensitetit të joneve). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 dhe >2-krasitja e zvogëlimit të intensivitetit ionov). Proteinat e ndryshuara dukshëm janë të theksuara me të kuqe (p <0.05 dhe >2-fish ndryshim në intensitetin e joneve).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в јоной силе). Proteinat e ndryshuara dukshëm janë të theksuara me të kuqe (p <0.05 dhe > 2-fish ndryshim në forcën jonike).Proteinat e lidhura, të rëndësishme për HEK293T-miniSOG, por jo të rëndësishme për HEK293T, tregohen me të gjelbër.e Analiza e specifikës së grupeve të të dhënave proteomike nga eksperimentet d.Numri i përgjithshëm i proteinave statistikisht të rëndësishme në çdo organelë (pika të kuqe dhe jeshile) është shënuar në krye.Histogramet tregojnë proteina të lokalizuara në organele bazuar në MitoCarta 3.0, analiza GO dhe A. Ting et al.njerëzit.Të dhëna të veçanta për mitokondritë, bërthamat dhe ER.Këto eksperimente u përsëritën në mënyrë të pavarur të paktën dy herë me rezultate të ngjashme.Të dhënat e papërpunuara ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave të papërpunuara.
I inkurajuar nga rezultatet e xhelit dhe imazherisë, u përdor sasia pa etiketë për të përcaktuar sasinë e proteomës së identifikuar në secilën organelë (Të dhënat Suplementare 2).HEK293T i patransfektuar u përdor si një kontroll negativ për të zbritur shënuesit e sfondit. Analiza e grafikut të vullkanit shfaqi proteina të pasuruara ndjeshëm (p <0.05 dhe >2-fish intensitet joni) si dhe proteina të vetme që janë të pranishme vetëm në linjat që shprehin miniSOG (Fig. 3d pika të kuqe dhe jeshile). Analiza e grafikut të vullkanit shfaqi proteina të pasuruara ndjeshëm (p <0.05 dhe >2-fish intensitet joni) si dhe proteina të vetme që janë të pranishme vetëm në linjat që shprehin miniSOG (Fig. 3d pika të kuqe dhe jeshile). Analiz grafika вулкана показал значительно обогащенные belki (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также огношные белки, которые присутствуют только в линиях, краткиSOG, ekspressi. Analiza e grafikut të vullkanit tregoi proteina të pasuruara ndjeshëm (p<0.05 dhe >2-fish intensitet joni) si dhe proteina të vetme që janë të pranishme vetëm në linjat që shprehin miniSOG (Fig. 3d, pika të kuqe dhe jeshile).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 （（p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 存 在于 在于 在于 表达 系 中 的 单一 （（图 红色 红色 绿色点 绿色点））。火山图 分析 显示 出 显着 的 （（p <0.05 和> 2 倍 强度 强度） 仅 存 在于 在于 在于 表达 系 的 蛋白质 蛋白质 （图 图 红色 。。。））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））, Analiz grafika вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 dhe> 2x ionnaя сила), a также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии на miniSOG (красные линии miniSOG (крас3). Analiza e grafikut të vullkanit zbuloi proteina të pasuruara ndjeshëm (p<0.05 dhe >2x forcë jonike) si dhe proteina të vetme të pranishme vetëm në linjën e shprehjes miniSOG (pika të kuqe dhe jeshile në Fig. 3d).Duke kombinuar këto të dhëna, ne identifikuam përkatësisht 1364, 461 dhe 911 proteina statistikisht të rëndësishme të membranës bërthamore, mitokondriale dhe ER të jashtme.Për të analizuar saktësinë e PDPL-së së lokalizuar nga organelat, ne përdorëm MitoCarta 3.0, Analizën e Ontologjisë Gjenetike (GO) dhe A. Ting et al.një grup të dhënash8 u përdor për mitokondritë, bërthamën dhe ER për të testuar specifikën e organeleve të proteinave të zbuluara, që korrespondon me një saktësi prej 73.4, 78.5 dhe 73.0% (Fig. 3e).Specifikimi i PDPL konfirmon se PDPL është një mjet ideal për identifikimin e proteomeve specifike të organeleve.Veçanërisht, analiza subokondriale e proteinave mitokondriale të identifikuara tregoi se proteoma e bllokuar u shpërnda kryesisht në matricë dhe membranën e brendshme (226 dhe 106, respektivisht), duke përbërë 91.7% (362) të numrit të përgjithshëm të proteinave mitokondriale të identifikuara.një nivel i lartë i PDPL u konfirmua gjithashtu (Fig. 7a plotësuese).Në mënyrë të ngjashme, analiza nënbërthamore tregoi se proteoma e kapur ishte e shpërndarë kryesisht në bërthamë, nukleoplazmë dhe nukleolus (Figura plotësuese 7b).Analiza proteomike bërthamore me një peptid sinjali të lokalizimit bërthamor (3xNLS) tregoi saktësi të ngjashme me konstruktin H2B (Figura plotësuese 7c-h).Për të përcaktuar specifikën e shënuesit PDPL, laminina bërthamore A u zgjodh si një kurth POI7 më i lokalizuar në mënyrë diskrete.PDPL identifikoi 36 proteina të pasuruara në mënyrë të konsiderueshme, nga të cilat 12 proteina (30.0% duke përfshirë laminën A) ishin proteina të mirë-karakterizuara ndërvepruese me lamin A, të shënuara nga baza e të dhënave String, me një përqindje më të lartë se metoda BioID (122 proteina) 28 nga 28. , 22.9 %) 7. Metoda jonë identifikoi më pak proteina, ndoshta për shkak të zonave të kufizuara të etiketimit, gjë që u bë e mundur nga oksigjeni i vetëm aktiv më aktiv.Analiza GO tregoi se proteinat e identifikuara ishin kryesisht të vendosura në nukleoplazmë (26), në membranën bërthamore (10), në membranën bërthamore (9) dhe në poret bërthamore (5).Së bashku, këto proteina të lokalizuara bërthamore përbënin 80% të proteinave të pasuruara, duke demonstruar më tej specifikën e PDPL (Figura suplementare 8a-d).
Pasi kemi vendosur aftësinë e PDPL për të kryer shënimin e afërsisë në organele, ne testuam nëse PDPL mund të përdoret për të analizuar partnerët e lidhjes POI.Në veçanti, ne kërkuam të përcaktojmë analizën PDPL të proteinave citosolike, të cilat konsiderohen si objektiva më të vështira sesa homologët e tyre të lokalizuar në membranë për shkak të natyrës së tyre shumë dinamike.Proteina bromodomain dhe ekstraterminale (BET) BRD4 ka tërhequr vëmendjen tonë për rolin e saj kyç në sëmundje të ndryshme 35, 36.Kompleksi i formuar nga BRD4 është një koaktivizues transkriptues dhe një objektiv i rëndësishëm terapeutik.Duke rregulluar shprehjen e faktorëve të transkriptimit c-myc dhe Wnt5a, BRD4 mendohet të jetë një përcaktues kryesor i leuçemisë mieloide akute (AML), mielomës së shumëfishtë, limfomës Burkitt, kancerit të zorrës së trashë dhe sëmundjeve inflamatore37,38.Përveç kësaj, disa viruse synojnë BRD4 për të rregulluar transkriptimin viral dhe qelizor, si papillomavirusi, HIV dhe SARS-CoV-236,39.
Për të hartuar ndërveprimin BRD4 duke përdorur PDPL, ne kombinuam miniSOG me një izoformë të shkurtër N- ose C-terminale të BRD4.Rezultatet proteomike zbuluan një shkallë të lartë mbivendosjeje midis dy konstrukteve (Figura plotësuese 9a).Proteoma bërthamore e identifikuar me miniSOG-H2B mbulon 77.6% të proteinave që ndërveprojnë me BRD4 (Fig. Suplementare 9b).Më pas, u përdorën kohë të ndryshme ndriçimi (2, 5, 10, 20 min) për të rregulluar rrezen e shënuesit (Fig. 4a dhe të dhënat shtesë 3).Ne konkludojmë se në fotoperiodat më të shkurtra, PDPL do të etiketojë kryesisht partnerët e lidhjes direkte, ndërsa periudhat më të gjata do të përfshijnë proteinat e identifikuara gjatë periudhave më të shkurtra të fotoaktivizimit, si dhe objektivat indirekte në komplekset e etiketimit.Në fakt, gjetëm mbivendosje të fortë midis pikave kohore ngjitur (84.6% për 2 dhe 5 min; 87.7% për 5 dhe 10 min; 98.7% për 10 dhe 20 min) (Fig. 4b dhe Fig. Suplementare 9c).Në të gjitha grupet eksperimentale, ne gjetëm jo vetëm vetë-etiketimin BRD4, por disa objektiva të njohur si MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A dhe HMGB1 të shënuar në bazën e të dhënave të vargjeve.Fuqia jonike e këtyre objektivave është proporcionale me kohën e ekspozimit (Fig. 4c dhe Fig. Suplementare 9d).Analiza GO e proteinave të identifikuara në grupin 2-minutësh tregoi se proteinat e identifikuara ishin të lokalizuara në bërthamë dhe ishin të përfshira në rimodelimin e kromatinës dhe funksionin e ARN polimerazës.Funksioni molekular i proteinës u pasurua me lidhjen e kromatinës ose koaktivizimin transkriptues, në përputhje me funksionin BRD4 (Fig. 4d).Analiza e ndërveprimit të proteinave të aktivizuar nga baza e të dhënave string zbuloi një nivel të parë të ndërveprimeve indirekte midis komplekseve ndërvepruese të familjes BRD4 dhe HDAC si SIN3A, NCOR2, BCOR dhe SAP130 (Fig. 4e dhe Fig. Suplementare 9e), në përputhje me BRD4 dhe HDAC histonet e acetiluara që lidhin ..Përveç kësaj, objektivat përfaqësues të identifikuar nga LC-MS/MS, duke përfshirë Sin3A, NSUN2, Fus dhe SFPQ, u konfirmuan nga Western blotting (Fig. 4f).Kohët e fundit, izoforma e shkurtër e BRD4 është raportuar të formojë bërthama me veçori të ndarjes së fazës së lëngshme-lëngshme (LLPS).Proteinat lidhëse të ARN-së Fus dhe SFPQ ndërmjetësojnë LLPS-në e proceseve të ndryshme qelizore dhe janë identifikuar këtu si proteina lidhëse BRD4 të paregjistruara.Ndërveprimi midis BRD4 dhe SFPQ u konfirmua nga eksperimentet e bashkë-imunoprecipitimit (co-IP) (Figura 4g), duke sugjeruar një mekanizëm tjetër për ndarjen e fazës së lëngshme-lëngshme të ndërmjetësuar nga BRD4 që meriton hetim të mëtejshëm.Të marra së bashku, këto rezultate sugjerojnë se PDPL është një platformë ideale për identifikimin e proteinave të njohura që ndërveprojnë me BRD4, si dhe proteinat e panjohura lidhëse.
një paraqitje skematike e shënimit të afërsisë BRD4 të ndërmjetësuar nga miniSOG, kohët e ekspozimit: 2, 5, 10 dhe 20 min.b Mbivendosja e proteinave të identifikuara në kohë të ndryshme ndriçimi.Pasurimi i proteinave i identifikuar në HEK293T-miniSOG-BRD4 ishte statistikisht i rëndësishëm në krahasim me HEK293T të tipit të egër.c Intensiteti i joneve kur përcaktohen proteinat përfaqësuese të paetiketuara të njohura që lidhen me BRD4 gjatë kohës së specifikuar të ekspozimit.n = 3 mostra biologjikisht të pavarura.Të dhënat paraqiten si mesatare ± devijimi standard.d Analiza ontologjike gjenetike (GO) e proteinave të identifikuara në grupin 2-minutësh.Dhjetë termat e parë GO janë renditur.Flluskat ngjyrosen sipas kategorisë së termit GO dhe madhësia e flluskave është proporcionale me numrin e proteinave që gjenden në çdo term.e Analiza e vargut të proteinave që ndërveprojnë me BRD4.Rrathët e verdhë janë ngjitës direkt dhe rrathët gri janë shtresa e parë e ngjitësit indirekt.Vijat e kuqe përfaqësojnë ndërveprimet e përcaktuara eksperimentalisht dhe vijat blu përfaqësojnë ndërveprimet e parashikuara.f Objektivat detyruese përfaqësuese të BRD4 të identifikuara në LC-MS/MS u verifikuan me Western blotting.g Eksperimentet e bashkë-imunoprecipitimit konfirmojnë ndërveprimin midis SFPQ dhe BRD4.Këto eksperimente u përsëritën në mënyrë të pavarur të paktën dy herë me rezultate të ngjashme.Të dhënat e papërpunuara ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave të papërpunuara.
Përveç identifikimit të objektivave të paregjistruara të lidhura me POI, ne supozojmë se PDPL do të jetë e përshtatshme për identifikimin e substrateve për enzimat, të cilat do të kërkonin karakterizimin e proteinave lidhëse indirekte në komplekse të mëdha për të shënuar substrate të paregjistruara.Parkin (i koduar nga PARK2) është një ligazë E3 dhe mutacionet në parkin dihet se shkaktojnë sëmundjen e Parkinsonit të mitur autosomale recesive (AR-JP)42.Përveç kësaj, parkina është përshkruar si thelbësore për mitofagjinë (autofagji mitokondriale) dhe heqjen e specieve reaktive të oksigjenit.Megjithatë, edhe pse janë identifikuar disa substrate parkine, roli i parkinës në këtë sëmundje mbetet i paqartë.Për të shënuar nënshtresat e tij të pakarakterizuara, PDPL u testua duke shtuar miniSOG në skajin N- ose C të parkinës.Qelizat u trajtuan me transportuesin e protonit karbonil cianid m-klorofenilhidrazone (CCCP) për të aktivizuar parkinën nëpërmjet rrugës PINK1-Parkin.Krahasuar me rezultatet tona të BRD4 PDPL, bashkimi i terminalit N të parkinës zbuloi një grup më të madh të proteinave të synuara, megjithëse mbulonte një pjesë më të madhe të terminalit C (177 nga 210) (Figura 5a,b dhe të dhënat plotësuese 4).rezultati është në përputhje me raportet se etiketat N-terminale mund të aktivizojnë në mënyrë të gabuar Parkin44.Çuditërisht, kishte vetëm 18 proteina të mbivendosura në të dhënat tona me rezultatet e publikuara të AP-MS për Parkin43, me gjasë për shkak të dallimeve midis linjave qelizore dhe rrjedhave të punës së proteomikës.Përveç katër proteinave të njohura (ARDM1, HSPA8, PSMD14 dhe PSMC3) të identifikuara me dy metoda (Fig. 5c)43.Për të vërtetuar më tej rezultatet e LC-MS/MS, trajtimi PDPL dhe blotimi pasues Western u përdorën për të krahasuar rezultatet e analizës së qelizave mëmë HEK293T dhe linjës së qëndrueshme N-terminale të parkinës.Objektivat e panjohur më parë CDK2, DUT, CTBP1 dhe PSMC4 u testuan me një lidhës të njohur, DNAJB1 (Fig. 5d).
Grafiku i vullkanit të proteinave që ndërveprojnë me parkin në qelizat HEK293T me miniSOG të shprehur në mënyrë të qëndrueshme të shkrirë në skajin N- ose C të parkinës (n = 3 eksperimente biologjike të pavarura).T-testi studentor me dy bishta u përdor në parcelat e vullkanit.HEK293T u përdor si një kontroll negativ. Proteinat e ndryshuara dukshëm janë të theksuara me të kuqe (p <0.05 dhe >2-fish diferenca e intensitetit të joneve). Proteinat e ndryshuara dukshëm janë të theksuara me të kuqe (p <0.05 dhe >2-fish diferenca e intensitetit të joneve). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 dhe >2-krasitja e zvogëlimit të intensivitetit ionov). Proteinat e ndryshuara dukshëm janë të theksuara me të kuqe (p <0.05 dhe >2-fish ndryshim në intensitetin e joneve).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в јоной силе). Proteinat e ndryshuara dukshëm janë të theksuara me të kuqe (p <0.05 dhe > 2-fish ndryshim në forcën jonike).Proteinat e lidhura, të rëndësishme për HEK293T-miniSOG, por jo të rëndësishme për HEK293T, tregohen me të gjelbër.b Diagrami i Venit që tregon proteinat e mbivendosura ndërmjet konstrukteve N-terminal dhe C-terminal.Etiketat N-terminale mund të aktivizojnë në mënyrë të gabuar parkin dhe të rezultojnë në proteina më të njohura.c Diagrami i Venit që tregon proteinat e mbivendosura midis PDPL dhe AP-MS.Ndërvepruesit e njohur janë renditur, duke përfshirë 4 nga 18 proteinat e mbivendosura dhe 11 nga 159 proteinat e identifikuara në mënyrë specifike në PDPL.d Objektivat përfaqësues të identifikuar nga LC-MS/MS u verifikuan me Western blotting.e Ssu72 dhe SNW1 u identifikuan si nënshtresa parkine të paregjistruara.Këto plazmide proteinike të etiketuara me FLAG u transfektuan në HEK293T dhe HEK293T-Parkin-miniSOG të ndjekur nga trajtimi CCCP në momente të ndryshme kohore.Degradimi ishte më i theksuar në linjën e mbishprehjes së Parkinit.f Duke përdorur frenuesin e proteazomës MG132, u konfirmua se procesi i degradimit të Ssu72 dhe SNW1 ndërmjetësohet nga proteazoma-ubiquitinimi.Këto eksperimente u përsëritën në mënyrë të pavarur të paktën dy herë me rezultate të ngjashme.Të dhënat e papërpunuara ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave të papërpunuara.
Veçanërisht, proteinat e identifikuara nga PDPL duhet të përfshijnë proteinat që lidhin parkin dhe substratet e tyre.Për të zbuluar substrate parkine të paregjistruara, ne zgjodhëm shtatë proteina të identifikuara (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 dhe SNW1) dhe plazmide të transfektuara për t'i ekspozuar këto gjene ndaj HEK293T normale dhe për të shprehur në mënyrë të qëndrueshme trajtimin e miniSOG-Parkin's CPCC9 të ndjekur nga HEK2.Nivelet e proteinave Ssu72 dhe SNW1 u reduktuan ndjeshëm në linjën e qëndrueshme miniSOG-Parkin (Fig. 5e).Trajtimi me CCCP për 12 orë rezultoi në degradimin më domethënës të të dy substrateve.Për të hetuar nëse degradimi i Ssu72 dhe SNW1 rregullohet nga proteazoma-ubikuitinimi, frenuesi i proteazomit MG132 u shtua për të frenuar aktivitetin e proteazomës dhe në fakt zbuluam se procesi i degradimit të tyre ishte frenuar (Fig. 5f).Objektiva shtesë jo-substrate u konfirmuan si ndërveprues Parkin duke përdorur Western blotting (Fig. Suplementare 10), i cili tregoi rezultate të qëndrueshme me LC-MS/MS.Si përfundim, integrimi i rrjedhës së punës PDPL me verifikimin e transfeksionit të proteinës së synuar lejon identifikimin e substrateve të ligazës E3 të paregjistruara.
Ne kemi zhvilluar një platformë të përbashkët për shënimin e afërsisë që ju lejon të identifikoni POI-të që ndërveprojnë në hapësirë ​​dhe kohë.Platforma bazohet në proteinën fotosensibilizuese miniSOG, e cila është vetëm rreth 12 kDa, më pak se gjysma e madhësisë së enzimës së pjekur APEX2 (27 kDa) dhe një e treta e madhësisë së TurboID (35 kDa).Madhësia më e vogël duhet të zgjerojë shumë gamën e aplikimeve për studimin e ndërveprimeve të vogla të proteinave.Eksplorimi i mëtejshëm i fotosensibilizuesve shtesë, qofshin proteina të koduara gjenetikisht ose molekula të vogla, nevojitet për të rritur rendimentin kuantik të oksigjenit të vetëm dhe për të zgjeruar ndjeshmërinë e kësaj qasjeje.Për versionin aktual të miniSOG, rezolucion i lartë kohor mund të arrihet duke përdorur ndriçimin blu për të aktivizuar shënuesit e afërsisë.Përveç kësaj, koha më e gjatë e ekspozimit lëshoi ​​një "re" më të madhe të oksigjenit të vetëm, duke rezultuar në modifikimin e më shumë mbetjeve distale të histidinës, rritjen e rrezes së etiketimit dhe aftësinë për të rregulluar mirë rezolucionin hapësinor PDPL.Ne gjithashtu testuam shtatë sonda kimike për të rritur raportin sinjal-sfond dhe eksploruam mekanizmin molekular pas kësaj qasjeje.Rrjedha e punës TOP-ABPP e kombinuar me kërkimin e hapur të paanshëm konfirmoi se modifikimet ndodhën vetëm në histidinat dhe asnjë mikromjedis konsistent nuk u vu re për modifikime të rritura të histidinës, përveç një preference të moderuar për histidinat në rajonin e lakut.
PDPL është përdorur gjithashtu për të karakterizuar proteomet nënqelizore me specifikë dhe mbulim të proteomeve të paktën të krahasueshme me metodat e tjera të etiketimit të afërsisë dhe provës kimike specifike të organeleve.Shënuesit e afërsisë janë përdorur gjithashtu me sukses për të karakterizuar sipërfaqen, lizozomin dhe proteomet e lidhura me sekretomin46,47.Ne besojmë se PDPL do të jetë në përputhje me këto organele nënqelizore.Përveç kësaj, ne sfiduam PDPL duke identifikuar objektivat për lidhjen e proteinave citozolike që janë më komplekse se proteinat e lidhura me membranën për shkak të vetive të tyre dinamike dhe përfshirjes në ndërveprime më të përkohshme.PDPL u aplikua në dy proteina, koaktivizuesin transkriptues BRD4 dhe ligazën E3 Parkin të lidhur me sëmundjen.Këto dy proteina u zgjodhën jo vetëm për funksionet e tyre themelore biologjike, por edhe për rëndësinë e tyre klinike dhe potencialin terapeutik.Për këto dy POI, u identifikuan partnerë të njohur detyrues si dhe objektiva të paregjistruar.Veçanërisht, proteina SFPQ e lidhur me ndarjen e fazës u konfirmua nga co-IP, e cila mund të tregojë një mekanizëm të ri me të cilin BRD4 (izoforma e shkurtër) rregullon LLPS.Në të njëjtën kohë, ne besojmë se identifikimi i substrateve Parkin është një skenar në të cilin kërkohet identifikimi i ngjitësve indirekt.Ne identifikuam dy substrate parkin të paidentifikuar dhe konfirmuam degradimin e tyre përgjatë rrugës ubiquitinim-proteazomë.Kohët e fundit, një strategji e bllokimit të bazuar në mekanizëm është zhvilluar për të zbuluar substratet hidrolazë duke i bllokuar ato me enzima.Edhe pse kjo është një metodë shumë e fuqishme, ajo nuk është e përshtatshme për analizën e substrateve të përfshira në formimin e komplekseve të mëdha dhe kërkon formimin e lidhjeve kovalente midis enzimës dhe substratit.Ne presim që PDPL të mund të zgjerohet për të studiuar komplekse të tjera proteinash dhe familje enzimash, të tilla si familjet deubiquitinase dhe metalloprotease.
Një formë e re e miniSOG, e quajtur SOPP3, është zhvilluar me prodhim të përmirësuar të oksigjenit të vetëm.Ne krahasuam miniSOG me SOPP3 dhe gjetëm performancë të përmirësuar të shënimit, megjithëse raporti sinjal-zhurmë mbeti i pandryshuar (Figura plotësuese 11).Ne supozuam se optimizimi i SOPP3 (p.sh., përmes evolucionit të drejtuar) do të çonte në proteina fotosensibilizuese më efikase që kërkojnë kohë më të shkurtra drite dhe kështu do të lejonin kapjen e proceseve qelizore më dinamike.Veçanërisht, versioni aktual i PDPL është i kufizuar në mjedisin qelizor pasi kërkon ndriçim të dritës blu dhe nuk mund të depërtojë në inde të thella.Kjo veçori përjashton përdorimin e tij në studimet e modeleve të kafshëve.Megjithatë, kombinimi i optogjenetikës me PDPL mund të ofrojë një mundësi për kërkime mbi kafshët, veçanërisht në tru.Përveç kësaj, fotosensibilizues të tjerë infra të kuqe të projektuar gjithashtu e heqin këtë kufizim.Aktualisht po zhvillohen kërkime në këtë fushë.
Linja qelizore HEK293T u mor nga ATCC (CRL-3216).Linja qelizore rezultoi negative për infeksionin e mikoplazmës dhe u kultivua në DMEM (Thermo, #C11995500BT) i plotësuar me 10% serum fetusi të gjedhit (FBS, Vistech, #SE100-B) dhe 1% penicilinë/streptomicinë (Hyclone, #SV30010).rritur në.
3-Aminofenilen (kampioni 3) dhe (4-etinilfenil)metanamina (kampioni 4) u blenë nga Bidepharm.Propylamina (sonda 2) është blerë nga Energy-chemicals.N-(2-Aminofenil)pent-4-inamidi (sonda 1) u sintetizua sipas metodave të publikuara.
Tabela plotësuese 1 liston konstruktet gjenetike të përdorura në këtë studim.Sekuencat miniSOG dhe KillerRed u klonuan nga një plazmid dhuratë nga P. Zou (Universiteti i Pekinit).Sekuenca e synimit të matricës mitokondriale u përftua nga aminoacidet 23 N-terminale të COX4 dhe u klonua në vektorët e treguar duke përdorur një asamble Gibson (Beyotime, #D7010S).Për të synuar membranën dhe bërthamën e rrjetës endoplazmatike, ADN njerëzore SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) e përforcuar me PCR nga një bibliotekë cDNA e qelizave HEK293T dhe ADN H2B (dhuruar nga D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) dhe klonuar, siç u përmend më lart.Nëse nuk tregohet ndryshe, gjene të tjera proteinike të përdorura për transfeksionin dhe ndërtimin e linjave qelizore të qëndrueshme u përforcuan PCR nga biblioteka cDNA e qelizave HEK293T.G3S (GGGS) dhe G4S (GGGGS) u përdorën si lidhës midis proteinës së karremit dhe miniSOG.Një etiketë epitopi V5 (GKPIPNPLLGLDST) iu shtua këtyre konstruksioneve të bashkimit.Për shprehje te gjitarët dhe për të krijuar një linjë qelizore të qëndrueshme, konstrukti i shkrirjes miniSOG u nënklonua në vektorin lentiviral pLX304.Për shprehjen bakteriale, miniSOG u klonua në vektorin pET21a të etiketuar 6xHis në C-terminus.
Qelizat HEK293T u mbollën në 2.0 x 105 qeliza për pus në pllaka me gjashtë puseta dhe u transfektuan 24 orë më vonë me plazmide lentivirale rekombinante (2.4 μg pLX304) dhe plazmide paketuese virale (1.5 μg psPAG2 dhe 1.2 μg psPAG2 dhe 1.2 μg 0,00, me pMDo2, duke përdorur 0Bepo2. , #C0533), rreth 80% shkrirje.Pas transfeksionit gjatë natës, mjedisi u ndryshua dhe u inkubua për 24 orë të tjera.Mbledhja e virusit u krye pas 24, 48 dhe 72 orësh.Përpara infektimit të linjave qelizore të synuara, mjedisi viral u filtrua përmes një filtri 0.8 μm (Merck, #millex-GP) dhe u shtua polibreni (Solarbio, #H8761) në një përqendrim prej 8 μg/ml.Pas 24 orësh, qelizat u lejuan të rikuperohen duke ndryshuar mjedisin.Qelizat u zgjodhën duke përdorur 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) për tre pasazhet e para si një përzgjedhje më e rreptë.Më pas përdoret 20 μg/ml si një regjim më i rreptë për tre pasazhet e ardhshme.
Qelizat u mbollën në dhomat me 12 pusi (Ibidi, #81201) me një densitet prej afërsisht 20,000 qeliza për pus.Për të përmirësuar ngjitjen e qelizave HEK293T, shtoni 50 µg/ml fibronektinë (Corning, #356008) të holluar në kripë të kripur të puferuar me fosfat (PBS, Sangon, #B640435) në 37°C.Dhomat u trajtuan paraprakisht për 1 orë dhe më pas u hoqën me PBS.Pas 24 orësh, qelizat u lanë një herë me PBS, u inkubuan me sondë 1 mM 3 në solucion kripë të ekuilibruar të freskët të Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) për 1 orë në 37°C dhe më pas u inkubuan me një LED blu (460 nm ).) u rrezatuan për 10 minuta në temperaturën e dhomës.Pas kësaj, qelizat u lanë dy herë me PBS dhe u fiksuan me formaldehid 4% në PBS (Sangon, #E672002) për 15 minuta në temperaturën e dhomës.Formaldehidi i tepërt u hoq nga qelizat fikse duke u larë tre herë me PBS.Më pas qelizat u përshkuan me 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) në PBS dhe u lanë 3 herë me PBS.Më pas hiqni dhomën dhe shtoni në çdo kampion 25 µl të një përzierjeje të reaksionit të klikimit që përmban 50 µM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) dhe 0,5 mg/ml askorbat natriumi (Aladdin, nr. S105024) dhe inkubohen për 30 minuta në temperaturën e dhomës.Pas një reagimi të menjëhershëm, qelizat u lanë gjashtë herë me PBS që përmban 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) dhe më pas u bllokuan me 5% BSA (Abcone, #B24726) në PBST për 30 minuta në temperaturën e dhomës.
Për imuno-ngjyrosjen e kolokalizimit, qelizat u inkubuan me antitrupa parësorë sipas kushteve të treguara: etiketa anti-V5 e miut mAb (1:500, CST, #80076), lepuri anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), Antitrupi poliklonal anti-calnexin lepuri (1:500, Abcam, #ab22595) ose antitrup monoklonal anti-laminë lepuri A/C (1:500; CST, #2032) në 4 °C gjatë natës.Pas larjes 3 herë me PBST, qelizat u inkubuan me antitrupa dytësorë: Alexa Fluor 488 kundër lepujve të dhisë (Thermo, #A11034) i holluar 1:1000, Alexa Fluor 594 kundër miut të dhisë (CST, #8889) i holluar 1:10.hollim Hollohet në temperaturën e dhomës për 30 minuta.Më pas qelizat u lanë 3 herë me PBST dhe u ngjyrosën me DAPI (Thermo, #D1306) në PBS për 10 minuta në temperaturën e dhomës.Pas 3 larjeve me PBS, qelizat u mbyllën në glicerinë 50% (Sangon, #A600232) në PBS për imazhe.Imazhet imunofluoreshente u morën duke përdorur një mikroskop konfokal ZEISS LSM 900 Airyscan2 dhe softuerin ZNE 3.5.
Për imazhe fluoreshente me oksigjen të vetëm, qelizat u lanë dy herë me tampon Hanks HEPES përpara se të shtonin 100 nM Si-DMA në buferin Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Pas ekspozimit ndaj dritës, qelizat u inkubuan në një inkubator CO2 në 37°C për 45 minuta.Më pas, qelizat u lanë dy herë me tampon HEPES të Hanks dhe u ngjyrosën me Hoechst në tampon HEPES të Hanks për 10 minuta në temperaturën e dhomës dhe u vizualizuan duke përdorur një mikroskop konfokal ZEISS LSM 900., #M36008) në tampon HBSS që përmban kalcium dhe magnez.Pas ekspozimit ndaj dritës ose doxorubicinës (MCE, #HY-15142A), qelizat u inkubuan në një inkubator CO2 në 37° C. për 10 minuta, u lanë dy herë me bufer HBSS dhe u inkubuan me Hoechst në tampon HBSS në temperaturën e dhomës.minuta.Doxorubicina u përdor si një kontroll pozitiv i sondës ku qelizat u trajtuan me 20 μM doxorubicin në HBSS që përmban 1% BSA për 30 minuta.Imazhet imunofluoreshente janë marrë duke përdorur një mikroskop konfokal Zeiss LSM 900.
Qelizat HEK293T që shprehin në mënyrë të qëndrueshme mito-miniSOG u mbollën me një densitet prej afërsisht 30% në enë 15 cm.Pas 48 orësh, kur u arrit bashkimi ~ 80%, qelizat u lanë një herë me PBS, u inkubuan me 1 mM Probe 3 në tampon të freskët HBSS për 1 orë në 37°C dhe më pas u ndriçuan me një LED blu për 10 minuta në dhomë. temperatura..Më pas, qelizat u lanë dy herë me PBS, u kruan dhe u risuspenduan në tampon PBS të ftohtë me akull që përmban frenues proteazë pa EDTA (MCE, #HY-K0011).Qelizat u lizuan duke sonikuar majën për 1 minutë (1 sekondë në dhe 1 sekondë jashtë në amplitudë 35%).Përzierja që rezulton u centrifugua në 15,871 xg për 10 minuta në 4°C për të hequr mbeturinat dhe përqendrimi i supernatantit u rregullua në 4 mg/mL duke përdorur një kit analize të proteinës BCA (Beyotime, #P0009).Kombinoni 1 ml të lizës së mësipërme me azid të biotinës fotodegradueshme 0,1 mM (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM ligand TBTA (Aladdin, #T162437) dhe 1 mM SO4 incub rrotullohet për 1 orë në temperaturën e dhomës.Pas një reaksioni të menjëhershëm, shtoni përzierjen në tretësirën e parapërzier (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) në një shishkë qelqi 10 ml.Mostrat u përzien dhe u centrifuguan në 4500 g për 10 minuta në temperaturën e dhomës.Tretësirat e poshtme dhe të sipërme u hodhën, precipitati u la dy herë me 1 ml metanol dhe u centrifugua në 15871 × g për 5 minuta në 4 ° C.Shtoni 1 ml ure 8 M (Aladdin, nr. U111902) në bikarbonat amoniumi 25 mM (ABC, Aladdin, nr. A110539) për të tretur precipitatin.Mostrat u rikonstituuan me 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 në 25 mM ABC) për 40 minuta në 55°C të ndjekur nga shtimi i 15 mM jodoacetamide të freskët (Sangon, #A600539) në temperaturën e dhomës në errësirë.Alkilimi brenda 30 minutave..Një dithiothreitol shtesë prej 5 mM u shtua për të ndaluar reagimin.Përgatitni afërsisht 100 µl rruaza agaroze NeutrAvidin (Thermo, #29202) për çdo kampion duke larë 3 herë me 1 ml PBS.Tretësira e mësipërme e proteomes u hollua me 5 ml PBS dhe u inkubua me rruaza agaroze NeutrAvidin të lara paraprakisht për 4 orë në temperaturën e dhomës.Rruazat më pas u lanë 3 herë me 5 ml PBS që përmban 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 herë me 5 ml PBS që përmban 1M ure dhe 3 herë me 5 ml ddH2O.Rruazat u korrën më pas me centrifugim dhe u risuspenduan në 200 μl 25 mM ABC që përmban 1 M ure, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) dhe 20 ng/μl tripsinë (Promega, #V5280).Tripsinizimi gjatë natës në 37°C me rrotullim.Reagimi u ndal duke shtuar acid formik (Thermo, # A117-50) derisa pH arriti në 2-3.Rruazat u lanë 3 herë me 1 ml PBS që përmban 0,2% SDS, 3 herë me 1 ml PBS që përmban 1 M ure dhe më pas 3 herë me 1 ml ujë të distiluar.Peptidet e modifikuara u lëshuan me lizë të lehtë (365 nm) për 90 minuta duke përdorur 200 μl MeOH 70%.Pas centrifugimit, supernatanti u mblodh.Rruazat u lanë një herë me 100 μl 70% MeOH dhe supernatantët u grumbulluan.Mostrat u thanë në një koncentrator vakum Speedvac dhe u ruajtën në -20°C deri në analizë.
Për të identifikuar dhe për të përcaktuar sasinë e peptideve të modifikuara të oksigjenit të vetëm, mostrat u rishpërndanë në acid formik 0,1% dhe 1 μg peptide u analizuan duke përdorur një spektrometër masi Orbitrap Fusion Lumos Tribrid të pajisur me një burim nano ESI nga Tune dhe Xcalibur nga softueri i shitësit 4.3.Mostrat u ndanë në një kolonë kapilare 75 µm × 15 cm të mbushur brenda me material C18 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) dhe u lidhën me një sistem EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptidet u ndanë me kromatografi lineare gradient 95 minuta nga 8% tretës B në 50% tretës B (A = 0.1% acid formik në ujë, B = 0.1% acid formik në 80% acetonitril), më pas u rrit në mënyrë lineare në 98% B min. në 6 min me një shpejtësi prej 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos mbledh të dhëna në mënyrë alternative midis skanimit të plotë MS dhe skanimit MS2 në varësi të të dhënave.Tensioni i spërkatjes u vendos në 2.1 kV dhe temperatura e kapilarit të transportit të joneve ishte 320°C.Spektrat MS (350-2000 m/z) u mblodhën me një rezolucion prej 120,000, AGC 4 × 105 dhe një kohë maksimale hyrëse prej 150 ms.10 prekursorët më të zakonshëm të ngarkuar shumëfish në çdo skanim të plotë u fragmentuan duke përdorur HCD me një energji përplasjeje të normalizuar prej 30%, një dritare izolimi katërpolësh prej 1,6 m/z dhe një vendosje rezolucioni prej 30,000.Një objektiv AGC për spektrometrinë e masës së bashku duke përdorur 5×104 dhe kohën maksimale të hyrjes 150 ms.Përjashtimi dinamik është vendosur në 30 sekonda. Jonet e pacaktuara ose ato me ngarkesë 1+ dhe >7+ u refuzuan për MS/MS. Jonet e pacaktuara ose ato me ngarkesë 1+ dhe >7+ u refuzuan për MS/MS. Jonaзначенные ионы или ионы со зарядом 1+ dhe >7+ были отклонены за МС/МС. Jonet e pacaktuara ose jonet me ngarkesë 1+ dhe >7+ u refuzuan për MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы со зарядами 1+ dhe >7+ были отклонены для МС/МС. Jone ose jone të paspecifikuara me ngarkesa 1+ dhe >7+ u refuzuan për MS/MS.
Të dhënat e papërpunuara përpunohen duke përdorur platformën informatike FragPipe bazuar në MSFragger.Paragjykimet në masë dhe aminoacidet përkatëse u përcaktuan duke përdorur një algoritëm kërkimi të hapur me një tolerancë në masë pararendëse prej -150 deri në 500 Da.Peptidet e modifikuara më pas u identifikuan duke përdorur modifikime të histidinës me fitime në masë prej +229,0964 dhe +247,1069 Da në PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Qelizat që shprehin në mënyrë të qëndrueshme gjenin e shkrirë miniSOG u vendosën në enë 6 cm.Me arritjen e bashkimit ~ 80%, qelizat u lanë një herë me HBSS (Gibco, #14025092), më pas u inkubuan me sonda kimike në HBSS për 1 orë në 37°C dhe u ndriçuan me dritë blu.10W LED për 20 minuta në temperaturën e dhomës.Për të përcaktuar se cili lloj i specieve reaktive të oksigjenit është i përfshirë në PDPL, 0,5 mM vitaminë C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 iu shtuan qelizave si shtesa.Pas larjes me PBS të ftohtë, qelizat u kruan, u mblodhën në tuba centrifuge 1.5 ml dhe u sonikuan me një majë për 1 min në 200 μl PBS me 1x frenues proteaze pa EDTA (1 s dhe 1 s pa, amplituda 35%).Përzierja që rezulton u centrifugua në 15,871 × g për 10 minuta në 4 ° C dhe përqendrimi i supernatantit u rregullua në 1 mg/mL duke përdorur një komplet të analizës së proteinës BCA.Përafërsisht 50 μl e lizatit të mësipërm u inkubuan me 0.1 mM azid rodaminë (Aladdin, nr. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM ligand TBTA dhe 1 mM CuSO4 për 1 orë në temperaturën e dhomës me rrotullim nga poshtë lart.Pas reaksionit të klikimit, u krye precipitimi me aceton duke shtuar 250 μl aceton të ftohur paraprakisht në kampione, duke u inkubuar në -20°C për 20 minuta dhe duke u centrifuguar në 6010×g për 10 minuta në 4°C.Mblidheni peletin dhe zieni në 50 µl të 1 x tampon Laemmli për 10 minuta në 95 °C.Mostrat u analizuan më pas në xhel të gjatë SDS-PAGE dhe u vizualizuan duke përdorur sistemin e imazhit Bio-rad ChemiDoc MP Touch me softuerin Image Lab Touch.
Shprehja dhe pastrimi i proteinës rekombinante miniSOG-6xHis u krye siç u përshkrua më parë.Shkurtimisht, qelizat E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) u transformuan me pET21a-miniSOG-6xHis dhe shprehja e proteinave u nxit me 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Pas lizës së qelizave, proteinat u pastruan duke përdorur rruaza agaroze Ni-NTA (MCE, nr. 70666), u dializuan kundër PBS dhe u ruajtën në -80°C.
Për një analizë in vitro të etiketës së afërsisë së bazuar në antitrupa, përzieni miniSOG të pastruar 100 μM, sondë 3 1 mM dhe 1 μg antitrup monoklonal të miut anti-etiketë (TransGen, #HT501-01) në PBS në një vëllim total reaksioni prej 50 μl..Përzierja e reaksionit u rrezatua me dritë blu LED për 0, 2, 5, 10 dhe 20 minuta në temperaturën e dhomës.Përzierja u inkubua me 0.1 mM biotin-PEG3-azid (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM ligand TBTA dhe 1 mM CuSO4 për 1 orë në temperaturën e dhomës në një tundës me lëvizje lart.Pas një reagimi të menjëhershëm, shtoni 4 herë tampon Laemmli's direkt në përzierje dhe zieni në 95°C për 10 min.Mostrat u analizuan në xhel SDS-PAGE dhe u analizuan me western blotting me streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Një peptid sintetik që përmban histidinë me amidim C-terminal (LHDALDAK-CONH2) u përdor për të analizuar etiketimin in vitro të afërt me bazë peptide.Në këtë analizë, miniSOG i pastruar 100 μM, sondë 3 10 mM dhe peptid sintetik 2 μg/ml u përzien në PBS në një vëllim total reaksioni prej 50 μl.Përzierja e reaksionit u rrezatua me dritë blu LED për 1 orë në temperaturën e dhomës.Një mikrolitër kampion u analizua duke përdorur një sistem LC-MS (SyNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight spektrometër masiv me softuerin e analizës së spektrit MassLynx).
Qelizat HEK293T që shprehin në mënyrë të qëndrueshme gjenin e shkrirjes miniSOG u mbollën në enë 10 cm për linja me lokalizim të ndryshëm të organeleve (Mito, ER, Nucleus) dhe enë 15 cm për linjat Parkin-miniSOG dhe BRD4-miniSOG.Me arritjen e bashkimit ~ 90%, qelizat u lanë një herë me HBSS, më pas u inkubuan me sondën 3 në HBSS për 1 orë në 37°C dhe u ndriçuan me një LED blu 10 W në temperaturën e dhomës.Për etiketimin pa kontakt të Parkinit, 10 μM proton karbonil cianid bartës m-klorofenilhidrazone CCCP (Solarbio, #C6700) me sondën 3 në HBSS u shtua për 1 orë në 37°C.Hapat e lizës së qelizave, kimisë së klikimit, reduktimit dhe alkilimit ishin të njëjta me ato të përshkruara më sipër, përveç se 2 mg lizatë u shtuan dhe azidi i biotinës PEG3 u përdor në reaksionin e klikimit në vend të azidit të biotinës fotodegradueshme.Pas pasurimit, rruazat u lanë 3 herë me 5 ml PBS që përmban 0,2% SDS, 3 herë me 5 ml PBS që përmban 1 M ure dhe 3 herë me 5 ml PBS.Më pas, 2 µg tripsinë u shtuan në 300 µl 25 mM ABC që përmban 1 M ure për të copëtuar proteinën gjatë natës në 37°C.Reaksioni u ndal duke shtuar acid formik derisa u arrit një pH prej 2-3.Pas tripsinizimit në rruaza, tretësira e peptidit u shkripëzuar duke përdorur një kolonë SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) dhe u tha në një koncentrues vakum Speedvac.Peptidet u rishpërndanë në acid formik 0,1% dhe 500 ng peptide u analizuan duke përdorur një spektrometër masi Orbitrap Fusion Lumos Tribrid të pajisur me burimin nano-ESI të përshkruar më sipër.Peptidet u ndanë në kolonat komerciale RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, nr. 164946) dhe kolonat analitike RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, nr. 164941), të dyja të mbushura me 2 μm.gradient nga 8% në 35% ACN në 60 minuta, më pas u rrit në mënyrë lineare në 98% B në 6 minuta me një shpejtësi rrjedhjeje prej 300 Nl/min.Spektrat MS (350-1500 m/z) u mblodhën me një rezolucion prej 60,000, AGC 4 × 105 dhe një kohë maksimale hyrëse prej 50 ms.Jonet e përzgjedhura u fragmentuan në mënyrë sekuenciale nga HCD në cikle 3 sekondash me një energji përplasjeje të normalizuar prej 30%, një dritare izolimi katërpolësh prej 1.6 m/z dhe një rezolucion prej 15000. Një objektiv AGC spektrometër masiv tandem 5 × 104 dhe një kohë maksimale injektimi janë përdorur prej 22 ms.Përjashtimi dinamik është vendosur në 45 sekonda. Jonet e pacaktuara ose ato me ngarkesë 1+ dhe >7+ u refuzuan për MS/MS. Jonet e pacaktuara ose ato me ngarkesë 1+ dhe >7+ u refuzuan për MS/MS. Jonaзначенные ионы или ионы со зарядом 1+ dhe >7+ были отклонены за МС/МС. Jonet e pacaktuara ose jonet me ngarkesë 1+ dhe >7+ u refuzuan për MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы со зарядами 1+ dhe >7+ были отклонены для МС/МС. Jone ose jone të paspecifikuara me ngarkesa 1+ dhe >7+ u refuzuan për MS/MS.
Hapat e përgatitjes së mostrës deri në pasurimin e rruazave NeutrAvidin ishin të njëjta si në analizën LC-MS/MS të përshkruar më sipër.Përafërsisht 50 μg lizatë u përdor si hyrje për kontrollin e ngarkimit dhe 2 mg lizatë u përdor për reaksionet e klikimit.Pas pasurimit dhe larjes me neutravidinë, proteinat e lidhura u eluan duke shtuar 50 μl bufer Laemmli në rruazat e rrëshirës së agarozës dhe duke zier në 95°C për 5 minuta.Futja e ngarkesës së kontrollit dhe mostrat e pasuruara me rruaza u analizuan me SDS-PAGE dhe u transferuan në membranat PVDF (Milipore, #ISEQ00010) me metoda standarde Western blot.Membranat u bllokuan me 5% qumësht të skremuar (Sangon, #A600669) në TBS që përmban 0.1% tween-20 (TBST) dhe u inkubuan në mënyrë sekuenciale me antitrupa parësorë dhe sekondarë.Antitrupat primare u holluan 1:1000 në 5% qumësht të skremuar në TBST dhe u inkubuan gjatë natës në 4°C.Antitrupat sekondarë u përdorën në një raport 1:5000 dhe u inkubuan për 1 orë në temperaturën e dhomës.Membranat u vizualizuan me anë të kimilumineshencës duke përdorur sistemin e imazhit Chemidoc MP.Të gjitha skanimet e paprera të njollave dhe xhelit në figurë janë paraqitur si të dhëna të papërpunuara.
Antitrupat parësorë të përdorur në këtë studim përfshinin antitrupin monoklonal anti-SFPQ lepuri (CST, nr. 71992), antitrupin monoklonal anti-FUS lepuri (CST, nr. 67840), antitrupin poliklonal anti-NSUN2 lepuri (Proteintech, nr. 20854-1- AP), antitrup poliklonal anti-mSin3A lepuri (Abcam, #ab3479), antitrup monoklonal kundër etiketës së miut (TransGen, #HT201-02), antitrup monoklonal anti-β-aktinë miu (TransGen, #HC201-01), antitrup lepuri -Antrupi monoklonal CDK2 (ABclonal, #A0094), antitrupi monoklonal i lepurit ndaj CTBP1 (ABclonal, #A11600), antitrupi poliklonal i lepurit ndaj DUT (ABclonal, #A2901), antitrupi poliklonal i lepurit ndaj PSMC4 (ABclonal, #A2505), Antitrupi poliklonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Këto antitrupa u përdorën në një hollim 1:1000 në qumësht 5% të skremuar në TBST.Antitrupat dytësorë të përdorur në këtë studim përfshinin IgG kundër lepurit (TransGen, #HS101-01), IgG kundër miut (TransGen, #HS201-01) në një hollim 1:5000.
Për të hetuar më tej nëse BRD4 ndërvepron me SFPQ, qelizat e qëndrueshme HEK293T dhe BRD4-miniSOG që shprehin tepër HEK293T u vendosën në enë 10 cm.Qelizat u lanë me PBS të ftohtë dhe u lizuan në 1 ml pierce IP tampon lize (Thermo Fisher, #87787) me frenues proteazë pa EDTA për 30 minuta në 4°C.Pas kësaj, lizat u mblodhën në tuba centrifuge 1.5 ml dhe u centrifuguan në 15,871 xg për 10 minuta në 4°C.Supernatanti u mblodh dhe u inkubua me 5 μg të antitrupit monoklonal të miut të etiketuar anti-V5 (CST, #80076) gjatë natës në 4°C.Lani afërsisht 50 µl rruaza magnetike të proteinës A/G (MCE, #HY-K0202) dy herë me PBS që përmban 0,5% Tween-20.Më pas lizatat e qelizave u inkubuan me rruaza magnetike për 4 orë në 4°C me rrotullim nga poshtë lart.Më pas rruazat u lanë katër herë me 1 ml pufer PBST dhe u zien në 95°C për 5 min.Mostrat u analizuan në xhel SDS-PAGE dhe u transferuan në membranat PVDF duke përdorur metoda standarde Western blot.Membranat u bllokuan në qumësht të skremuar 5% në TBST dhe u inkubuan në mënyrë sekuenciale me antitrupa parësorë dhe sekondarë.Antitrupi primar i lepujve antitrupi monoklonal anti-SFPQ (CST, #71992) u përdor në një raport 1:1000 në qumësht të skremuar 5% në TBST dhe u inkubua gjatë natës në 4°C.IgG kundër lepurit u përdor në një raport 1:5000 dhe u inkubua për 1 orë në temperaturën e dhomës.Membranat u vizualizuan me anë të kimilumineshencës duke përdorur sistemin e imazhit Chemidoc MP.
Të gjitha strukturat e përdorura për analizën e sipërfaqes së aksesueshme të tretësit (SASA) janë marrë nga Banka e të Dhënave të Proteinave (PDB)52 ose Baza e të Dhënave të Strukturës së Proteinave AlphaFold53.SASA absolute u llogarit për çdo mbetje duke përdorur programin FreeSASA.Vetëm të dhëna të plota dhe të paqarta SASA për histidinën e etiketuar dhe fqinjët e saj u përdorën për të marrë mesataren SASA për secilën strukturë.Aksesueshmëria relative ndaj tretësit (RSA) për secilën histidinë u llogarit duke pjesëtuar vlerën absolute SASA me sipërfaqen maksimale të mundshme empirike të mbetjes në dispozicion të tretësit.Të gjitha histidinat u klasifikuan më pas si të fshehura nëse RSA mesatare ishte nën 20%, përndryshe ekspozoheshin56.
Skedarët e papërpunuar të marrë në modalitetin DDA u kërkuan duke përdorur Proteome Discoverer (v2.5) ose MSfragger (Fragpipe v15.0) në bazën e të dhënave përkatëse të proteinave të verifikuara SwissProt që përmban ndotës të zakonshëm.Peptidet kërkonin tripsinë të plotë me dy zona ndarjeje që mungojnë, metilimin e karbamoilit si modifikim fiks dhe oksidimin e metioninës si modifikim dinamik.Tolerancat e peshës së prekursorëve dhe fragmenteve u vendosën në 10 ppm dhe 0.02 Da (MS2 Orbitrap), respektivisht. Goditjet e ndotësve u hoqën dhe proteinat u filtruan për të marrë një shkallë të rreme zbulimi prej <1%. Goditjet e ndotësve u hoqën dhe proteinat u filtruan për të marrë një shkallë të rreme zbulimi prej <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Goditjet e ndotësve u hoqën dhe proteinat u filtruan për të dhënë një shkallë zbulimi të rremë prej <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, a belki отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Goditjet e ndotësve u hoqën dhe proteinat u filtruan për të arritur një normë false pozitive prej <1%.Për analizën sasiore pa përdorimin e etiketave, u përdor përmbajtja e proteinave të normalizuara nga tre përsëritje biologjike.Analiza e lokalizimit nënqelizor të proteinave u krye duke përdorur analizën Gene Ontology (GO) nga DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 dhe bazat e të dhënave të përpiluara dhe publikuara nga grupi Alice Ting.Harta e vullkanit është marrë nga Perseus (v1.6.15.0). Ndryshimet e palosjes së bollëkut të proteinave u testuan për rëndësi statistikore duke përdorur një T-test të dyanshëm, dhe goditjet e proteinave u identifikuan me ndryshimin e bollëkut >2 (përveç nëse përcaktohet ndryshe) dhe vlerën p <0.05. Ndryshimet e palosjes së bollëkut të proteinave u testuan për rëndësi statistikore duke përdorur një T-test të dyanshëm, dhe goditjet e proteinave u identifikuan me ndryshimin e bollëkut >2 (përveç nëse përcaktohet ndryshe) dhe vlerën p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость со использованием двустороннего t-kriteriя, и совпадения белков были идентифицированы изменением содержания> 2 (если не е забелешка, 5. Ndryshimet e nivelit të përmbajtjes së proteinave u testuan për rëndësi statistikore duke përdorur një T-test me dy bishta, dhe përputhjet e proteinave u identifikuan me ndryshimin e përmbajtjes >2 (përveç nëse shënohet ndryshe) dhe vlerën ap <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明 和 和 p 值 <0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли со использованием двустороннего t-kriteriя, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иноей <0, и p. Rëndësia statistikore e ndryshimeve të palosshme në përmbajtjen e proteinave u testua duke përdorur një T-test me dy bishta dhe u përcaktuan ndeshjet e proteinave për ndryshimet e përmbajtjes >2 (nëse nuk tregohet ndryshe) dhe vlerat p <0,05.Analiza e ndërveprimit të proteinave u krye duke përdorur analizën GO së bashku me bazën e të dhënave String.
U kryen tre përsëritje biologjike me rezultate të ngjashme.Analiza statistikore është bërë me GraphPad Prism (softueri GraphPad) dhe parcelat e vullkanit janë gjeneruar me Perseus (v1.6.15.0).Për të krahasuar të dy grupet, vlerat p u përcaktuan duke përdorur një test studentor me dy bisht.Vetëm proteinat e vetme të identifikuara të paktën dy herë në grupin eksperimental u përfshinë në parcelat e vullkanit dhe vlerat përkatëse të munguara në grupin e kontrollit u zëvendësuan me Perseus nga një shpërndarje normale në mënyrë që të mund të llogaritet vlera p.Shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± devijimin standard.Në analizat proteomike për analiza statistikore, u ruajt bollëku i proteinave që u shfaq në të paktën dy kopje biologjike.Metodat statistikore nuk janë përdorur për të paracaktuar madhësinë e kampionit.Eksperimentet nuk janë të rastësishme.Studiuesit nuk ishin të verbër ndaj detyrave gjatë eksperimentit dhe vlerësimit të rezultateve.
Për më shumë informacion mbi hartimin e studimit, shihni abstraktin e Raportit të Kërkimit të Natyrës të lidhur me këtë artikull.
Të dhënat e spektrometrisë së masës të marra në këtë studim iu dorëzuan Konsorciumit ProteomeXchange nëpërmjet depove të partnerit iProX57 nën ID-në e të dhënave PXD034811 (data e të dhënave PDPL-MS).Të dhënat e papërpunuara ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave të papërpunuara.Ky artikull ofron të dhënat origjinale.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Njohja e lagjes: përdorimi i biotinilimit të varur nga afërsia për të karakterizuar komplekset e proteinave dhe hartën e organeleve. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Njohja e lagjes: përdorimi i biotinilimit të varur nga afërsia për të karakterizuar komplekset e proteinave dhe hartën e organeleve.Gingras, AS, Abe, KT dhe Raut, B. Njohja me mjedisin: përdorimi i biotinilimit të varur nga afërsia për të karakterizuar komplekset e proteinave dhe hartën e organeleve. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物质复合物徶并 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Të kuptuarit e lagjes: përdorni varësinë e lagjes nga jeta biologjike.Gingras, AS, Abe, KT dhe Raut, B. Kuptimi i afërsisë: karakterizimi i komplekseve proteinike dhe hartëzimi i organeleve duke përdorur biotinilimin e varur nga afërsia.Aktuale.Mendimi im.Kimike.biologji 48, 44–54 (2019).
Geri, JB etj.Harta e mikromjedisit duke transferuar energjinë e Dexter tek qelizat imune.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Rrjetet e shkallës me dy proteome zbulojnë rimodelimin specifik të qelizës së ndërveprimit njerëzor.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).