Lajme

Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Qelizat e kancerit kanë evoluar mekanizma të ndryshëm për të kapërcyer stresin qelizor dhe për të vazhduar përparimin.Protein kinaza R (PKR) dhe aktivizuesi i saj proteinik (PACT) janë reaguesit fillestarë që monitorojnë sinjale të ndryshme stresi që çojnë në frenimin e përhapjes së qelizave dhe apoptozës.Megjithatë, rregullimi i rrugës PACT-PKR në qelizat e kancerit mbetet kryesisht i panjohur.Këtu, ne zbuluam se ARN-ja e gjatë jo-koduese (lncRNA) aspartyl tRNA sintetaza antisense ARN 1 (DARS-AS1) është e përfshirë drejtpërdrejt në frenimin e rrugës PACT-PKR dhe promovon përhapjen e qelizave kancerogjene.Duke përdorur shqyrtimin funksional në shkallë të gjerë të lncARN-së të lidhur me kancerin CRISPRi 971, ne zbuluam se DARS-AS1 u shoqërua me rritjen e konsiderueshme të përhapjes së qelizave kancerogjene.Prandaj, nokauti DARS-AS1 pengon përhapjen e qelizave dhe promovon apoptozën e qelizave kancerogjene në linja të ndryshme qelizore kanceroze in vitro dhe redukton ndjeshëm rritjen e tumorit in vivo.Mekanikisht, DARS-AS1 lidhet drejtpërdrejt me domenin e aktivizimit PACT dhe parandalon ndërveprimin PACT-PKR, duke reduktuar kështu aktivizimin e PKR, fosforilimin eIF2α dhe duke penguar vdekjen apoptotike të qelizave.Klinikisht, DARS-AS1 shprehet gjerësisht në kancere të shumëfishta dhe mbishprehja e kësaj ARN-je është tregues i një prognoze të keqe.Ky studim sqaron rregullimin specifik të kancerit të rrugës PACT-PKR nga DARS-AS1 lncRNA dhe ofron një objektiv tjetër për prognozën dhe trajtimin e kancerit.
Aftësia për t'iu përshtatur stresit është një karakteristikë e rëndësishme e mbijetesës dhe përhapjes së qelizave kancerogjene.Përhapja e shpejtë dhe shenjat dalluese metabolike të kancerit arrijnë kulmin në mikromjedise të ashpra - privimi i lëndëve ushqyese, hipoksia dhe pH i ulët - që mund të nxisin rrugët sinjalizuese të vdekjes së qelizave.Disrregullimi i gjeneve të ndjeshme ndaj stresit si p535, proteinat e goditjes nga nxehtësia 6, 7, KRAS8, 9 dhe HIF-110, 11, 12, 13 vërehen shpesh në kancer, duke bllokuar apoptozën dhe duke nxitur mbijetesën.
Protein kinase R (PKR) është një sensor i rëndësishëm i stresit dhe një nënnjësi kinazë e faktorit 2α të fillimit eukariotik (eIF2α), një rregullator translator që lidh stresin qelizor me vdekjen e qelizave.PKR fillimisht u identifikua si një proteinë antivirale nga zbulimi i një ARN të huaj me dy zinxhirë (dsRNA).Pas aktivizimit, PKR fosforilon eIF2α për të penguar sintezën e proteinave virale dhe qelizore14,15,16.PACT (proteina aktivizuese PKR) është identifikuar si proteina e parë aktivizuese PKR në mungesë të dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Nëpërmjet ndërveprimit të drejtpërdrejtë me PKR, PACT transdukton strese të ndryshme (uria e serumit, trajtimi me peroksid ose arsenit) në PKR dhe rrugët e sinjalizimit në rrjedhën e poshtme.Përveç fosforilimit eIF2α, aktivizimi i PKR i ndërmjetësuar nga PACT shkakton ngjarje të ndryshme që lidhen me përgjigjen ndaj stresit, duke përfshirë ndryshimin e statusit redoks nëpërmjet rrugës PI3K/Akt24, kontrollin e përmirësuar të dëmtimit të ADN-së nëpërmjet p5325,26 dhe NF-κB27,28 Rregullon transkriptimin, 29. Duke pasur parasysh rolin e tyre kritik në përgjigjen ndaj stresit, përhapjen, apoptozën dhe proceset e tjera kyçe qelizore, PKR dhe PACT janë objektiva premtues terapeutikë për shumë sëmundje, veçanërisht kancerin30,31,32,33.Megjithatë, pavarësisht nga kjo rëndësi pleiotropike funksionale dhe biologjike, rregullimi i aktivitetit PACT/PKR në qelizat e kancerit mbetet i pakapshëm.
lncARN-të janë transkripte më të mëdha se 200 nukleotide pa potencial kodues proteinash.Meqenëse projektet më të fundit të sekuencës së të gjithë gjenomit kanë identifikuar mijëra lncARN, 35,36 janë bërë shumë përpjekje për të sqaruar funksionet e tyre biologjike.Një numër në rritje i kërkimeve ka treguar se lncARN-të janë të përfshirë në shumë procese biologjike37 duke përfshirë rregullimin e inaktivizimit të kromozomit X38,39, ngulitjen40, transkriptimin41,42, përkthimin43 dhe madje edhe rritjen e kancerit44,45,46,47.Këto studime raportuan se shumë lncARN janë të përfshirë në shtegun PACT/PKR.Një studim i tillë tregoi se lncRNA ASPACT pengoi transkriptimin e PACT dhe rriti mbajtjen bërthamore të PACT mRNA.Studime të tjera kanë treguar se lncARN nc886 lidhet me PKR dhe pengon fosforilimin e tij49,50.Deri më tani, lncRNA që rregullon aktivizimin e PKR të ndërmjetësuar nga PACT nuk është raportuar.
Aspartyl-tRNA sintetaza antisense ARN 1 (DARS-AS1) është identifikuar si një lncRNA onkogjenike51,52,53,54.Përmes rregullimit të miP-194-5p53, miP-12952 dhe miP-532-3p51, DARS-AS1 është treguar se promovon rritjen e karcinomës së qelizave renale me qeliza të qarta, karcinomës tiroide dhe karcinomës së mushkërive me qeliza jo të vogla, respektivisht.Tong dhe kolegët zbuluan gjithashtu se DARS-AS1 promovon përparimin e mielomës duke ruajtur stabilitetin e motivit të lidhjes së ARN-së të proteinës 39 (RBM39).Megjithatë, nuk janë kryer studime nëse kjo lncARN është e përfshirë në rregullimin e aktivizimit të PACT-PKR dhe përgjigjen ndaj stresit të qelizave kancerogjene.
Këtu, ne kryem një ekran në shkallë të gjerë të humbjes së funksionit duke përdorur sistemin CRISPRi dhe përcaktuam se DARS-AS1 lncRNA promovon përhapjen e disa llojeve të qelizave kancerogjene.Përveç kësaj, ne kemi identifikuar një mekanizëm kryesor: DARS-AS1 lidhet drejtpërdrejt me PACT, pengon lidhjen e PACT dhe PKR, parandalon fosforilimin e eIF2α, një substrat më i ulët PKR dhe në fund frenon vdekjen apoptotike të qelizave.Si përfundim, puna jonë zbulon DARS-AS1 lncRNA si një rregullator i rrugës PACT-PKR dhe një objektiv potencial për trajtimin dhe prognozën e kancerit.
Studime të gjera të profilizimit gjenomik kanë identifikuar qindra lncARN të lidhura me kancerin.Megjithatë, funksioni i tyre mbetet kryesisht i panjohur56.Për të identifikuar kandidatët premtues të lncARN të përfshirë në progresionin e kancerit, ne kryem një ekran të humbjes së funksionit për përhapje të reduktuar në linjën qelizore të kancerit kolorektal SW620 duke përdorur sistemin CRISPRi (Fig. 1a).Karakteristika unike e linjave qelizore të kancerit të zorrës së trashë SW480 dhe SW620 është se ato rrjedhin nga tumoret parësore dhe dytësore në një pacient të vetëm.Kjo ofron një krahasim të vlefshëm për studimin e ndryshimeve gjenetike në përparimin e kancerit të avancuar të zorrës së trashë.Prandaj, ne analizuam transkriptomet e linjave qelizore të kancerit kolorektal (SW480 dhe SW620) duke përdorur sekuencën e ARN-së dhe mblodhëm disa lncARN funksionale potenciale nga literatura e botuar.Bazuar në këto rezultate, ne krijuam një bibliotekë të bashkuar sgRNA që përmban 7355 oligo sgRNA që synojnë 971 lncARN të lidhura me kancerin dhe 500 oligo sgRNA të pashënjestruara për një kontroll negativ (Të dhënat Suplementare 1).
Paraqitja skematike e shqyrtimit duke përdorur sistemin CRISPRi.Pasurimi i b sgARN-së pas shqyrtimit.Vija horizontale me pika paraqet log2 (ndryshim i palosjes) = ±0,58.Vija vertikale me pika tregon vlerën p = 0,05.Pikat e zeza përfaqësojnë sgARN jo të synuar (të caktuar si NC).Pikat e kuqe janë sgARN që synojnë DARS-AS1.Pikat blu janë sgARN që synojnë LINC00205, një lncARN onkogjenike e përshkruar më parë.ndryshimi i palosjes = (leximi i normalizuar, dita 17)/(leximi i normalizuar, dita 0).c Knockdown i DARS-AS1 sgRNA pengoi rritjen e qelizave.Shiritat e gabimit përfaqësojnë ± devijimin standard të tre eksperimenteve.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 T-testi studentor me dy bisht.d Shprehja DARS-AS1 në tumore (Të dhënat e të dhënave TCGA).em Shprehja e DARS-AS1 në mostrat e çiftuara normale dhe tumorale nga pacientët me BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP dhe COAD, përkatësisht (data e të dhënave TCGA).P-vlerat janë marrë duke përdorur testin studentor t-test të çiftuar me dy bisht.
Pas ndërtimit të plazmidit dhe paketimit të lentivirusit, ne transduktuam linjën qelizore të kancerit kolorektal dCas9-SW620 me bibliotekën e mësipërme në katër eksperimente të pavarura të infeksionit.Shumësia e infeksionit (MOI) për këto infeksione ishte 0.1-0.3, që tregon se çdo qelizë mund të transfektohet vetëm me një sgARN.Pas 18 ditësh të kulturës in vitro, profili i pasurimit të sgARN-ve të synuar u ul ose u rrit pas ekzaminimit, ndërsa numri i oligonukleotideve të kontrollit jo të synuar mbeti relativisht i pandryshuar në krahasim me profilin para ekzaminimit, duke treguar se objektivi ynë ka një ekran shumë specifik. librari.Oriz.1b dhe tabelën plotësuese 1). LINC00205, i cili ishte raportuar më parë se promovonte kancerin e mushkërive dhe progresionin e kancerit të mëlçisë58,59,60, u ekzaminua (log2 (ndryshimi i palosjes) < -0,58, vlera p <0,05), duke konfirmuar besueshmërinë e këtij shqyrtimi (Fig. 1b). LINC00205, i cili ishte raportuar më parë se promovonte kancerin e mushkërive dhe progresionin e kancerit të mëlçisë58,59,60, u ekzaminua (log2 (ndryshimi i palosjes) < -0,58, vlera p <0,05), duke konfirmuar besueshmërinë e këtij shqyrtimi (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию лесни рака и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, верность 5 значение p <0, 1b). LINC00205, i raportuar më parë për promovimin e progresionit të kancerit të mushkërive dhe kancerit të mëlçisë58,59,60, u përjashtua (log2 (ndryshim në fish) <-0,58, vlera p <0,05), duke konfirmuar qëndrueshmërinë e këtij shqyrtimi (Fig. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 筛 筛 选 （（log2 （倍数 变化） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 了 该 该 筛选 可靠性 可靠性 图 图 图）。。。。。。。。。 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图, Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 筛 筛 选 （（log2 （倍数 变化） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 了 该 该 筛选 可靠性 可靠性 图 图 图）。。。。。。。。。 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图, LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию желби, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0, 1b). LINC00205, i raportuar më parë për promovimin e progresionit të kancerit të mushkërive dhe mëlçisë58,59,60, u përjashtua (log2 (ndryshim i fishuar) <-0,58, vlera p <0,05), duke konfirmuar qëndrueshmërinë e këtij shqyrtimi (Fig. .1b).
Midis të gjitha lncARN-ve të testuara, DARS-AS1 u ekzaminua gjithashtu, me tre oligonukleotidet përkatëse të sgARN-së të reduktuara ndjeshëm pas 18 ditësh kulture, duke sugjeruar që rrëzimi i kësaj lncARN rezultoi në zvogëlimin e përhapjes së kancerit (Fig. 1b).Ky rezultat u mbështet më tej nga analiza MTS në qelizat e kancerit kolorektal, duke treguar se shkalla e rritjes së qelizave të mpiksjes DARS-AS1 ishte vetëm përgjysmuar në krahasim me qelizat e kontrollit (Figura 1c) dhe ishte në përputhje me raportet e mëparshme të disa llojeve të tjera të kancerit.: kanceri i veshkave me qeliza të qarta, kanceri i tiroides dhe kanceri i mushkërive me qeliza jo të vogla51,52,53,55.Megjithatë, funksioni i tij dhe mekanizmat molekularë në kancerin kolorektal mbeten të paeksploruara.Prandaj, ne zgjodhëm këtë lncARN për studim të mëtejshëm.
Për të studiuar shprehjen e DARS-AS1 te pacientët, ne analizuam në mënyrë gjithëpërfshirëse 10,327 mostra tumori nga projekti Cancer Genome Atlas (TCGA).Rezultatet tona tregojnë se DARS-AS1 shprehet gjerësisht dhe rregullohet ndjeshëm në qelizat e shëndetshme në një sërë tumoresh, duke përfshirë adenokarcinomën e zorrës së trashë (COAD), karcinomën e qelizave të qarta renale (KIRC) dhe karcinomën e qelizave papilare të veshkave (KIRP)..Shumë pak (Fig. 1d dhe Fig. Suplementare 1a, b). Analiza e mostrave të çiftuara të shëndetshëm/tumor konfirmoi më tej një shprehje dukshëm më të lartë të DARS-AS1 në tumoret e karcinomës uroteliale të fshikëzës (BLCA), karcinomës së qelizave të qarta të veshkave (KIRC), adenokarcinoma të prostatës (PRAD), karcinomës së qelizave skuamoze të mushkërive (LUSC) , karcinoma endometriale e korpusit të mitrës (UCEC), adenokarcinoma e mushkërive (LUAD), karcinoma hepatoqelizore e mëlçisë (LIHC), karcinoma e qelizave papilare të veshkave (KIRP) dhe adenokarcinoma e zorrës së trashë (COAD) (vlera p < 0,05) (Fig. 1e–m) . Analiza e mostrave të çiftuara të shëndetshëm/tumor konfirmoi më tej një shprehje dukshëm më të lartë të DARS-AS1 në tumoret e karcinomës uroteliale të fshikëzës (BLCA), karcinomës së qelizave të qarta të veshkave (KIRC), adenokarcinoma të prostatës (PRAD), karcinomës së qelizave skuamoze të mushkërive (LUSC) , karcinoma endometriale e korpusit të mitrës (UCEC), adenokarcinoma e mushkërive (LUAD), karcinoma hepatoqelizore e mëlçisë (LIHC), karcinoma e qelizave papilare të veshkave (KIRP) dhe adenokarcinoma e zorrës së trashë (COAD) (vlera p < 0,05) (Fig. 1e–m) .Analiza e mostrave të çiftuara të shëndetshëm/tumor konfirmoi gjithashtu shprehje dukshëm më të lartë të DARS-AS1 në kancerin urotelial të fshikëzës (BLCA), karcinomën e qelizave renale dhe renale (KIRC), adenokarcinomën e prostatës (PRAD), kancerin e qelizave skuamoze të mushkërive (LUSC)., karcinoma endoometria tela maтки (UCEC), adenokarcinoma legkogo (LUAD), gepatocellyulyarnaya karcinoma pecheni (LIHC), papillyarno-kletoçina karcinoma pocki (KIRP) dhe adenokarcinoma tolstoAD) (00–0) (p. m) . , karcinoma endometriale e korpusit të mitrës (UCEC), adenokarcinoma e mushkërive (LUAD), karcinoma hepatoqelizore e mëlçisë (LIHC), karcinoma e qelizave papilare të veshkave (KIRP) dhe adenokarcinoma e zorrës së trashë (COAD) (vlera p < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 、 肾 透明 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 、 、 前列 、 、 、 细胞癌 肿瘤 肿瘤 肿瘤 肿瘤.显着 更 高 表达 子宫体子宫 子宫体子宫 内膜 （（UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） 肝肝 细胞癌 （（LIHC） 肾 肾 肾 乳头状 （（（（和结肠腺癌 和结肠腺癌 （（（（p 值<0,05) (图1e-m) .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 、 、 、 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 、 、 、 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌. (Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 癌 癌 （（（（） （（（（肝肝 细胞癌 （（（） 肾 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞,癌 (kirp) (koad) (p 值<0.05) (图1e-m) .Analiza e mostrave të çiftëzuara të shëndetshme/tumore mbështeti më tej rolin e DARS-AS1 në kancerin urotelial të fshikëzës (BLCA), karcinomën e qelizave renale me qeliza të qarta (KIRC), adenokarcinomën e prostatës (PRAD) dhe kancerin e qelizave skuamoze të mushkërive (LUSC).ekspresija me karcinome tela maтки (UCEC), adenokarcinome legkogo (LUAD), karcinome gepatocellyulyarnoy (LIHC), poчечно-почечной папиллярно-клеточной карцином (KIRP) dhe adenokarcinome legkogo (LUAD) (tolsto) -m). shprehja në karcinomën e korpusit të mitrës (UCEC), adenokarcinoma e mushkërive (LUAD), karcinoma hepatocelulare (LIHC), karcinoma e qelizave papilare renale (KIRP) dhe adenokarcinoma e zorrës së trashë (COAD) (vlera p <0,05) (Figura 1e -m).Të marra së bashku, këto rezultate tregojnë se DARS-AS1 shprehet gjerësisht dhe shumë në një sërë kanceresh.
Për shkak se DARS-AS1 dhe DARS (gjeni që kodon vargun antisens) ndajnë të njëjtin promotor dhe ndodhen pranë njëri-tjetrit, ne projektuam shRNA për të rrëzuar në mënyrë specifike DARS-AS1 por jo DARS (Fig. 2a,b dhe Tabela plotësuese 2 ) .Përveç SW620, ne përdorëm gjithashtu tre linja të tjera qelizore që shprehin shumë DARS-AS1 për të studiuar efikasitetin dhe funksionin e rrëzimit të shRNA (Tabela 3 plotësuese).Rezultatet tona treguan se të tre shARN-të e zhvilluara arritën të paktën 80% efikasitet të shkatërrimit të DARS-AS1 me pak efekt në sasinë e mRNA DARS (Figura plotësuese 2c-f).Për më tepër, ne zbuluam se rrëzimi i DARS-AS1 me këto shRNA frenoi ndjeshëm rritjen e qelizave në linjat qelizore të kancerit kolorektal SW620 (49.7%) dhe HCT116 (27.7%), linja qelizore e kancerit të gjirit MBA-MD-231 (53.4%).) dhe linja qelizore e hepatomës HepG2 (92,7% reduktim), si dhe aftësia e tyre për të formuar sfera të paankoruara (reduktimi mesatar prej ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% dhe 75,7% për linjë qelizore) (Fig. 2a,b).Në SW620, rezultatet e analizës së formimit të kolonive konfirmuan më tej se DARS-AS1 shRNA frenoi ndjeshëm përhapjen e qelizave me një ulje mesatare prej afërsisht 69,6% (Fig. 2c).
Efekti i shRNA e kontrollit dhe shRNA DARS-AS1 në përhapjen e qelizave (a) dhe formimin e sferoidit (b) në qelizat SW620, HCT116, MBA-MD-231 dhe HepG2.c Efekti i shRNA e kontrollit dhe shRNA DARS-AS1 në formimin e kolonive në qelizat SW620.Proliferimi qelizor (d), formimi i sferoideve (e) dhe formimi i kolonive (f) i qelizave SW620 që shprehin mbi DARS-AS1.Të dhënat e treguara janë mesatarja ± devijimi standard i tre eksperimenteve.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dhe *** p ≤ 0,001 nga T-testi studentor me dy bisht.
Për të plotësuar studimet e humbjes së funksionit, ne më pas krijuam qelizat SW620 që shprehin tepërt DARS-AS1 (Fig. suplementare 2g).Mbishprehja e DARS-AS1 rriti ndjeshëm rritjen e qelizave (1,8-fish), formimin e sferoideve të paankoruara (1,4-fish) dhe formimin e kolonive (3,3-fish) në qelizat SW620 (Fig. 2d-f).Ne e konfirmuam këtë rezultat duke përdorur një linjë tjetër qelizore shprehëse DARS-AS1, A549.Ky shtim i zgjeruar i qelizave për shkak të mbishprehjes së DARS-AS1 u vu re më tej në qelizat A549 (Fig. Suplementare 2h, i dhe Tabela Suplementare 3).Të marra së bashku, këto studime fitimi dhe humbjeje tregojnë se DARS-AS1 promovon përhapjen e qelizave kancerogjene in vitro.
Për të eksploruar mekanizmin themelor me anë të të cilit DARS-AS1 rregullon përhapjen e qelizave, ne kryem një analizë të tërheqjes së ARN-së për të identifikuar partnerët e saj të mundshëm për lidhjen e proteinave.Rezultatet e RT-qPCR treguan se rreth 86.2% e DARS-AS1 ndodhet në citoplazmën e qelizave SW620 (Fig. Suplementare 3a).DARS-AS1 ose pseudoRNA e biotiniluar e transkriptuar in vitro më pas u inkubua me lizate të qelizave SW620 e ndjekur nga ndarja SDS-PAGE.Ngjyrosja e mëvonshme e argjendit tregoi se një brez i veçantë (~ 38 kDa) ishte pasuruar ndjeshëm në mostrat tërheqëse të DARS-AS1, por jo në mostrat e ARN-së ose rruazave të rreme (Fig. 3a).Ky brez u identifikua si një proteinë aktivizuese PKR (PACT) me spektrometrinë e masës (MS) dhe u konfirmua më tej nga imunoblotting në linjat qelizore SW620, HCT116 dhe HepG2 (Fig. 3a,b).Pasurimi i DARS dhe proteinave të lidhura PACT - PKR dhe TRBP - u hetua gjithashtu duke përdorur analizën e ARN-së nga Western blotting (WB).Rezultatet treguan se nuk u gjet asnjë ndërveprim i drejtpërdrejtë midis ARN-së DARS-AS1 dhe këtyre tre proteinave (Figura plotësuese 3b).Ndërveprimi specifik midis DARS-AS1 dhe PACT u konfirmua më tej nga analiza e imunoprecipitimit të ARN-së (RIP), e cila tregoi se DARS-AS1 ishte pasuruar ndjeshëm me antitrupa anti-PACT, por jo me ARN të tjera kontrolli (Figura 3c).Për të përcaktuar nëse DARS-AS1 ndërvepron drejtpërdrejt me PACT në mungesë të ndonjë komponenti tjetër qelizor, u krye një analizë in vitro e interferometrisë së bishtresave (BLI) duke përdorur PACT të pastruar.DARS-AS1 ose ARN-ja e etiketuar me biotinë u imobilizua në biosensorët e streptavidinës (SA) dhe më pas u inkubua në tampon kinetik që përmban 1 μM PACT.Veçanërisht, PACT lidhet fort me DARS-AS1 (vlera KD ~ 26,9 nM), por jo për të imituar ARN (Figura 3d).Të marra së bashku, këto rezultate demonstrojnë një ndërveprim të drejtpërdrejtë dhe afinitet të lartë midis DARS-AS1 dhe PACT.
Analiza e tërheqjes së ARN-së identifikoi DARS-AS1 duke ndërvepruar me PACT në qelizat SW620.Më sipër, ngjyrosje argjendi e proteinave të lidhura.Imunoblote më të ulëta u kryen me antitrupa anti-PACT.b Analiza e tërheqjes së ARN-së u krye në qelizat HCT116 (lart) dhe HepG2 (poshtë).Pasurimi i PACT u zbulua nga imunoblotting.Analizat e imunoprecipitimit të cRNA (RIP) u kryen në qelizat SW620 duke përdorur antitrupat e treguar.d Lakoret e lidhjes PACT me DARS-AS1 me gjatësi të plotë ose ARN-në e kontrollit u morën duke përdorur interferometrinë e bishtresave (BLI).ARN u imobilizua në një biosensor të streptavidinës.1 μM PACT u përdor për të matur lidhjen.Analiza e tërheqjes së ARN-së u krye duke përdorur DARS-AS1 me gjatësi të plotë të biotiniluar ose të cunguar (lart).Imunobloti që tregon PACT të marrë (poshtë).f PACT me flamur të pastruar u inkubua me DARS-AS1 të plotë të biotiniluar ose të cunguar (si në e) për analizën RIP in vitro.ARN-ja e nxjerrë u verifikua me RT-qPCR.g Afiniteti relativ i fragmenteve të ndryshme të ARN-së për PACT është marrë duke përdorur interferometrinë e shtresave biologjike.Për analizë, janë përdorur 100 nM ARN dhe 1 μM RAST.h Analizat e RIP in vitro u kryen duke përdorur PACT të pastruar të paprekur ose të cunguar të etiketuar.ARN-ja e nxjerrë u verifikua me RT-qPCR.i Shkalla e rritjes së qelizave SW620 që mbishprehin DARS-AS1, PACT ose të dyja.j Shprehja e tepërt e DARS-AS1 me gjatësi të plotë ose të cunguar në qelizat SW620 kishte efekte të ndryshme në rritjen e qelizave.k Apoptoza u zbulua me imunoblotting me antitrupa anti-PARP.l Nokauti i DARS-AS1 shkakton apoptozën e qelizave SW620 siç tregohet nga citometria e rrjedhës.Të dhënat e treguara janë mesatarja ± devijimi standard i tre eksperimenteve. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, sipas testit t Studentit me dy bisht. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, sipas testit t Studentit me dy bisht. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 nga T-testi studentor me dy bisht. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 nga T-testi studentor me dy bisht.
Më pas krijuam tre fragmente të ARN-së të DARS-AS1 të biotiniluar me transkriptim in vitro për të identifikuar rajonin DARS-AS1 të kërkuar për lidhjen PACT (Figura 3e).Rezultatet e analizës së ARN-së treguan se çdo fragment ishte në gjendje të ndërvepronte me PACT, por rajoni 3'-terminal (384-768 nukleotide të emërtuara A3) tregoi më shumë se 1-384 nukleotide të etiketuara A1) (Fig. 3e).Rezultate të ngjashme u vunë re në analizën in vitro RIP duke përdorur PACT rekombinant (Figura 3f).Në përputhje me këto rezultate, eksperimentet për të lidhur fragmentet e ARN-së të imobilizuara me PACT duke përdorur BLI treguan gjithashtu se PACT ka një afinitet më të lartë për A3 (384-768 nt) (vlera KD prej afërsisht 94.6 nM), ndërsa pothuajse asnjë lidhje me zona të tjera.(Fig. 3d).
Ne ekzaminuam gjithashtu rajonet lidhëse të lidhura në PACT.PACT përmban tre domene funksionale, dy prej të cilave janë domene të konservuara me lidhje të dyfishtë të ARN-së (dsRBD) dhe një domen i tretë (i caktuar D3) që vepron si një aktivizues i ndërveprimeve të proteinave.Për të ekzaminuar kapacitetin lidhës të lncARN-së të çdo domeni, ne krijuam tre mutacione që hoqën secilin nga tre domenet dhe kryen një analizë in vitro RIP.Rezultatet tona treguan se fshirja e domenit të tretë (D3) të PACT uli ndjeshëm ndërveprimin e tij me DARS-AS1 (me 0,11 herë në krahasim me PACT të paprekur) në krahasim me dy mutacionet e tjera (Fig. 3h), u tregua se lëshimi e D3 ndërveproi me DARS.-AC1.Të marra së bashku, këto rezultate sugjerojnë se ndërveprimi midis DARS-AS1 dhe PACT mund të ndodhë kryesisht përmes fundit të 3' të DARS-AS1 dhe domenit D3 të PACT.
Ne vumë re se DARS-AS1 nuk kishte asnjë efekt në shprehjen PACT dhe PACT nuk kishte asnjë efekt në DARS-AS1 (Fig. Suplementare 3c).Më pas kemi ekzaminuar efektin e rrënimit të PACT në rritjen e qelizave.Në kontrast me DARS-AS1, qelizat relative u rritën 1.5-3 herë më shpejt kur PACT u rrëzua (Figura plotësuese 3d).Rezultatet e analizës së formimit të kolonive treguan se qelizat formuan koloni 2-3-fish pas trajtimit të shARN me PACT (Fig. Suplementare 3e).Për të testuar nëse DARS-AS1 rregullon përhapjen e qelizave përmes PACT, ne krijuam qeliza SW620 që shprehin tepërt PACT, DARS-AS1 ose të dyja.Mbishprehja e PACT tregoi frenim domethënës të proliferimit të qelizave (Figura 3i).Ndërsa mbishprehja e DARS-AS1 në vetvete promovoi ndjeshëm proliferimin e qelizave, nuk kishte asnjë ndryshim domethënës në shkallën e rritjes së qelizave që mbishprehin DARS-AS1 dhe PACT.Këto rezultate sugjerojnë se PACT mund të kundërshtojë rritjen e përhapjes së shkaktuar nga mbishprehja e DARS-AS1.
Meqenëse rajone të ndryshme të DARS-AS1 kanë aftësi të ndryshme lidhëse PACT, ne hetuam ndikimin e tyre relativ në përhapjen e qelizave nga mbishprehja e ndryshme e fragmenteve DARS-AS1.Krahasuar me dy fragmentet e tjera, DARS-AS1 u mbishprehur në fundin 3' (384-768 nt), rajoni kryesor i lidhur me PACT në DARS-AS1, i cili kishte aftësinë më të lartë për të stimuluar proliferimin qelizor (Fig. 3j).Këto rezultate tregojnë një korrelacion pozitiv midis kapacitetit lidhës dhe funksionit biologjik të DARS-AS1.
PACT është raportuar të jetë një proteinë pro-apoptotike19.Prandaj, ne hetuam efektin e DARS-AS1 në apoptozën.Siç pritej, rrëzimi i DARS-AS1 rriti ndjeshëm ndarjen e PARP në qelizat SW620 dhe rriti proporcionin e qelizave V-pozitive të aneksinës në linjat qelizore SW620, HCT116, HepG2 dhe MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f–h), duke treguar se efekti anti-apoptotik i DARS-AS1 në qelizat e kancerit është i kundërt me funksionin e PACT që nxit apoptozën.Të marra së bashku, këto rezultate sugjerojnë se mekanizmi i funksionit onkogjenik DARS-AS1 mund të jetë nëpërmjet frenimit të funksionit PACT.
Më pas, ne eksploruam implikimet funksionale të lidhjes DARS-AS1-PACT.Është raportuar se PACT aktivizon PKR përmes ndërveprimit të drejtpërdrejtë, i cili më pas rrit fosforilimin eIF2α, duke shkaktuar fshirje translative dhe apoptozë17.Së pari, ne shqyrtuam nëse DARS-AS1 ndikon në lokalizimin qelizor të PACT dhe PKR.Mikroskopi fluoreshent konfokal tregoi se PACT dhe PKR ishin shumë të kolokalizuara në qelizat SW620 me një koeficient mesatar korrelacioni Pearson prej 0.72.Ndërkohë, mbishprehja e DARS-AS1 uli ndjeshëm bashkëlokalizimin e PACT dhe PKR (koeficienti mesatar i korrelacionit Pearson 0.61) (Figura 4a).Për të hetuar nëse DARS-AS1 mund të modulojë ndërveprimin PACT-PKR, ne kryem një analizë të bashkë-imunoprecipitimit (co-IP) me antitrupa anti-PACT në lizat e qelizave SW620.PKR u pasurua shumë me anti-PACT në qelizat e kontrollit, ndërsa rikuperimi i PKR u reduktua ndjeshëm në lizatet nga qelizat që shprehnin tepër DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT dhe PKR të etiketuara të pastruara u përdorën për analizat in vitro të lidhjes së proteinave.Prandaj, ato që siguruan DARS-AS1 por pa ARN kontrolli treguan ndërveprim të shtypur PACT-PKR (Figura 4c).Të gjitha rezultatet treguan se DARS-AS1 ndërpreu komunikimin PACT dhe PKR.
Një bashkë-lokalizimi i PACT dhe PKR në qelizat e kontrollit ose qelizat që mbishprehin DARS-AS1 u vëzhgua duke përdorur mikroskopin fluoreshent konfokal.Bërthamat u ngjyrosën me DAPI.Rezultatet statistikore janë marrë nga 16 fotografi.b Ko-imunoprecipitimi (co-IP) duke përdorur antitrupa anti-PACT në lizat qelizore të qelizave të kontrollit SW620 ose qelizat që shprehin tepërt DARS-AS1.c PACT e etiketuar, PKR e pastruar dhe e transkriptuar in vitro me DARS-AS1 ose ARN të rreme u inkubuan për analizën e lidhjes së proteinave in vitro.Antitrupat kundër flamurit u përdorën për imunoprecipitim.d Imunoblote me antitrupat e treguar u kryen në qelizat SW620 dhe HCT116 të transfektuara me shRNA kontrolli ose DARS-AS1-shRNA e ndjekur nga uria në serum.Nivelet e shprehjes së DARS-AS1 ndryshuan ndjeshmërinë qelizore ndaj thapsigarginës.Qelizat SW620 u transfektuan me DARS-AS1 shRNA, plazmid të mbishprehjes DARS-AS1 ose plazmid kontrolli.Qelizat u trajtuan me thapsigargin për 48 orë dhe qëndrueshmëria e qelizave u përcaktua duke përdorur reagentin MTS.f DARS-AS1 i transkriptuar in vitro ose ARN-ja dummy dhe PACT i pastruar u përdorën për analizën e aktivizimit in vitro dhe zbulimin e imunoblotit.g Imunoblote duke përdorur këto antitrupa u kryen në qelizat SW620-ctrl (majtas) ose qeliza që mbishprehin mutantët PKR (djathtas).Këto qeliza më pas u transfektuan me shRNA kontrolli ose DARS-AS1-shRNA të ndjekura nga uria në serum.h Citometria e rrjedhës tregoi se inaktivizimi i mutantit PKR kompensoi apoptozën e induktuar nga DARS-AS1 në qelizat SW620.imunobllot me antitrupat e treguar u kryen në qelizat SW620 (majtas) ose HCT116 (djathtas).Qelizat e transfektuara me shRNA kontrolli ose shRNA DARS-AS1 janë të privuara nga serumi dhe plotësohen me 100 nM frenues PKR C16 ose DMSO.Shiriti i shkallës = 5 µm.Të dhënat e treguara janë mesatarja ± devijimi standard i tre eksperimenteve.* p ≤ 0,05 T-testi i studentit me dy bisht.
Në përgjithësi besohet se pasi PACT ndërvepron me PKR17, fosforilimi i PKR në Thr451 mund të induktohet.Rezultatet tona treguan se niveli i fosforilimit PKR u ngrit ndjeshëm në qelizat e ndara në DARS-AS1 pas urisë në serum (Fig. 4d dhe Fig. Suplementare 4a).Rrjedhimisht, ne zbuluam se fosforilimi i eIF2α, substrati kryesor i PKR, u rrit ndjeshëm nga shRNA DARS-AS1 (Fig. 4d dhe Fig. Suplementare 4a).Thapsigargin është një stresor ER që shkakton ER të lëshojë Ca2+.Trajtimi me thapsigargin është raportuar të nxisë shprehjen dhe aktivizimin e PACT, i cili më tej ndërvepron dhe aktivizon PKR, duke çuar në apoptozë duke rritur fosforilimin eIF2α 18,61.Këtu, ne përdorëm thapsigargin si një stimulues i rrugës PACT/PKR për të hetuar nëse DARS-AS1 mund të ndihmojë qelizat të kapërcejnë stresin duke frenuar rrugën PACT/PKR.Ne vumë re se niveli i shprehjes DARS-AS1 korreloi pozitivisht me rezistencën e qelizave ndaj thapsigargin.Qelizat SW620 me mbishprehje të DARS-AS1 mbijetuan më mirë kur trajtoheshin me thapsigargin, ndërsa qelizat me knockdown DARS-AS1 u bënë më të ndjeshme (Fig. 4e).Në përputhje me këto rezultate, mbishprehja e DARS-AS1 reduktoi fosforilimin e PKR-së të induktuar nga thapsigargin (Fig. suplementare 4b).Në të kundërt, pas trajtimit me thapsigargin, PKR dhe eIF2α u fosforiluan në një masë më të lartë në qelizat e kockdown DARS-AS1 krahasuar me qelizat e kontrollit (Fig. Suplementare 4b).Interesante, thapsigargin induktoi shprehjen DARS-AS1 në një mënyrë të varur nga doza, e cila mund të tregojë një funksion antistres të DARS-AS1 (Fig. Suplementare 4c).Përveç kësaj, ne kemi kryer analiza të aktivizimit in vitro për të konfirmuar këto vëzhgime.Shkurtimisht, PKR u pastrua nga lizatat e qelizave duke përdorur një antitrup anti-PKR, më pas u inkubua me PACT rekombinant dhe DARS-AS1 të transkriptuar in vitro.Pas reaksionit enzimatik, fosfo-PKR u zbulua duke përdorur WB.Rezultatet tona treguan se fosforilimi i PKR u frenua ndjeshëm nga DARS-AS1, por jo nga ARN-ja e kontrollit (Figura 4f).Këto rezultate in vitro dhe in vivo sugjerojnë që DARS-AS1 pengon aktivizimin e PKR të ndërmjetësuar nga PACT.Në të njëjtën kohë, ne kemi vërejtur gjithashtu një rënie në rikuperimin e PACT në prani të DARS-AS1 (Figura 4f).Ky rezultat është në përputhje me rezultatet e analizës in vitro të lidhjes së proteinave (Figura 4c) dhe përsëri ilustron funksionin bllokues të DARS-AS1 për lidhjen PACT-PKR.
Ser246 dhe Ser287 në domenin D3 të PACT kërkohen për aktivizimin e PKR nën stresin qelizor.Zëvendësimi i dy mbetjeve të serinës për alaninën dha PACT mutant (mutD), i cili aktivizoi PKR në mungesë të stresit dhe zëvendësimi për alaninën (mutA) përmbysi protokollin.Meqenëse kemi demonstruar rëndësinë e këtij domeni në lidhje të drejtpërdrejtë me DARS-AS1, ne krijuam këta dy mutantë PACT për të testuar nëse këto mbetje mund të përfshihen gjithashtu në ndërveprim me DARS-AS1.Interesante, të dy mutantët humbën aftësinë për t'u lidhur me DARS-AS1 (Fig. Suplementare 4d), duke sugjeruar se struktura e plotë e proteinës PACT mund të kërkohet për ndërveprim efikas me DARS-AS1.
Për më tepër, rezultatet tona sugjerojnë gjithashtu se frenimi i proliferimit qelizor i nxitur nga DARS-AS1-shRNA mund të restaurohet pjesërisht duke mbishprehur një mutant PACT negativ dominant (PACTmutA) ose një mutant PKR negativ dominant (PKRmut) (Fig. suplementare 4e. e).Shprehja e tepërt e mutantëve PKR dominantë-negativë reduktoi fosforilimin e PKR të shkaktuar nga rrëzimi i DARS-AS1 si dhe fosforilimi eIF2α në qelizat e privuara nga serumi (Fig. 4g).Më e rëndësishmja, përqindja e qelizave apoptotike të shkaktuara nga rënia e DARS-AS1 u zvogëlua gjithashtu në qelizat që mbishprehin PKRmut (Fig. 4h dhe Fig. Suplementare. 4g).Frenimi i aktivitetit të PKR kinazës dëmton gjithashtu funksionin DARS-AS1, pasi rezultatet treguan se rënia e DARS-AS1 rrallë shkaktonte fosforilimin e PKR dhe eIF2α kur qelizat trajtoheshin me një frenues C16 specifik për PKR (Fig. 4i dhe Fig. 4h).).Të marra së bashku, rezultatet tona sugjerojnë që DARS-AS1 promovon përhapjen e qelizave, të paktën pjesërisht, duke penguar aktivizimin e PKR të ndërmjetësuar nga PACT.
Për të eksploruar më tej rolin e DARS-AS1 në tumorigjenezën, ne kryem eksperimente in vivo duke përdorur një model ksenografti të miut. Rezultatet tregojnë se rënia e DARS-AS1 uli në mënyrë dramatike rritjen e tumorit te minjtë (p vlera < 0,0001) (Fig. 5a). Rezultatet tregojnë se rënia e DARS-AS1 uli në mënyrë dramatike rritjen e tumorit te minjtë (p vlera < 0,0001) (Fig. 5a). Rezuльтаты показывают, что nokdaun DARS-AS1 резко снижает рост опухоли во мышей (domethënia p <0,0001) (ris. 5a). Rezultatet tregojnë se rrëzimi i DARS-AS1 redukton në mënyrë drastike rritjen e tumorit te minjtë (vlera p <0,0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）、 Rezulьtatы pokazua, chto nokdaun DARS-AS1 do të zvogëlojë rritjen e ndjeshmërisë në shumë (domethënia р <0,0001) (ris. 5a). Rezultatet treguan se rrëzimi i DARS-AS1 uli ndjeshëm rritjen e tumorit te minjtë (p vlera < 0,0001) (Figura 5a).Kështu, në grupin e goditjes DARS-AS1, pati një rënie të konsiderueshme në vëllimin mesatar të tumorit me rreth 72.9% dhe masën mesatare të tumorit me rreth 87.8% (Figura 5b-d).Këto rezultate sugjerojnë fuqimisht se DARS-AS1 mund të nxisë ndjeshëm rritjen e tumorit in vivo.
Efektet e rrëzimit të DARS-AS1 në onkogjenezën kolorektal në minj nudo.Tregohen kthesat e rritjes (a), madhësia e tumorit (b), pesha (c) dhe imazhet e tumorit (d).Shiritat e gabimit përfaqësojnë ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, nga testi i Studentit t dy bisht. n = 10. ****p < 0,0001, nga testi i Studentit t dy bisht. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 T-testi studentor me dy bisht.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 T-testi studentor me dy bisht.e Kaplan-Meier analizoi korrelacionin midis niveleve të shprehjes DARS-AS1 dhe mbijetesës së përgjithshme në pacientët me UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM dhe LGG.Nivelet e larta të shprehjes DARS-AS1 te pacientët ishin në 50% të lartë;Niveli i ulët i shprehjes së DARS-AS1 te pacientët ishte në 50% të ulët.P-vlerat u përcaktuan duke përdorur testin e renditjes log.f Modeli i propozuar në të cilin DARS-AS1 rregullon rrugën PACT-PKR dhe rritjen e tumorit.
Për të kuptuar më mirë ndikimin klinik të DARS-AS1, ne shqyrtuam lidhjen midis shprehjes së tij dhe mbijetesës së pacientit.Duke analizuar grupin e të dhënave TCGA, ne zbuluam se shprehja më e lartë e DARS-AS1 u shoqërua me melanomën uveale (UVM), kromofobinë renale (KICH), karcinomën e qelizave papilare të veshkave (KIRP), mesothelioma (MESO), multipleks.Mbijetesa më e ulët u shoqërua ndjeshëm me morfozën e glioblastomës (GBM) dhe pacientët me gliomë të shkallës së ulët të trurit (LGG) (Figura 5e).Këto rezultate sugjerojnë se DARS-AS1 mund të luajë një rol të rëndësishëm në përparimin klinik të tumorit dhe mund të jetë një biomarker potencial parashikues në kancere të shumëfishta.
Në këtë studim, duke përdorur shqyrtimin funksional CRISPRi në shkallë të gjerë, ne përcaktuam se DARS-AS1 lncARN kapërcen stresin e qelizave kancerogjene duke rregulluar dy reagues kyç të stresit, PACT dhe PKR.Duke ndërvepruar drejtpërdrejt me PACT, DARS-AS1 frenoi aktivizimin e PKR të ndërmjetësuar nga PACT, duke parandaluar kështu vdekjen e qelizave apoptotike dhe duke nxitur përhapjen e qelizave (Fig. 5f).Rritja e rregullimit të DARS-AS1 është vërejtur në lloje të shumta të kancerit, duke sugjeruar se funksioni i tij për të promovuar mbijetesën e qelizave kancerogjene në kushte stresuese mund të jetë gjerësisht i zbatueshëm për lloje të shumta kanceri.
PACT është identifikuar si një proteinë aktivizuese PKR dhe aktivizimi i PKR i ndërmjetësuar nga PACT luan një rol të rëndësishëm në përgjigjet ndaj stresit duke rregulluar transkriptimin, përkthimin, apoptozën dhe procese të tjera të rëndësishme qelizore62.Për dekada, janë bërë përpjekje për të kuptuar rregullimin specifik të kancerit të kaskadës PACT-PKR.Këtu, studimi ynë zbuloi një mekanizëm të ndryshëm të rregullimit të PACT-PKR në qelizat kancerogjene përmes lncARN-së qelizore DARS-AS1, e cila lidhet drejtpërdrejt me PACT, bllokon ndërveprimin PACT-PKR, pengon aktivizimin e PKR dhe fosforilimin eIF2α, duke frenuar kështu apoptozën e shkaktuar nga stresi dhe stimulimi i përhapjes eventuale të kancerit.qelizat.Ky zbulim hedh dritë mbi objektivat e mundshëm të lncRNA për prognozën dhe terapinë e kancerit.
Të dhënat tona treguan se rrëzimi i DARS-AS1 sensibilizon qelizat ndaj urisë në serum me një rritje të konsiderueshme të PKR të fosforiluar dhe eIF2α.Këto rezultate sugjerojnë se DARS-AS1 promovon mbijetesën e qelizave kancerogjene në kushte të vështira duke penguar aktivitetin PACT/PKR.Disa ARN të tjera jo-koduese, të tilla si ASPACT dhe nc886, përfshihen gjithashtu në boshtin PACT/PKR duke ulur mRNA PACT48 ose duke rregulluar autofosforilimin duke u lidhur me PKR49,50,64.Midis tyre, DARS-AS1 vepron si përçarës i shoqatës PACT-PKR.Ky studim pasuron të kuptuarit tonë për rregullimin e boshtit PACT/PKR dhe rolin e lncARN-ve në përgjigjet ndaj stresit.
PACT përmban tre fusha të veçanta.Secili nga dy dsRBD-të e para është i mjaftueshëm për të arritur lidhjen me afinitet të lartë të PACT me PKR, ndërsa domeni i tretë (D3) kërkohet për aktivizimin e PKR in vitro dhe in vivo.Studimi ynë tregoi se DARS-AS1 ndërvepron në mënyrë preferenciale me domenin D3 (Fig. 3h).Duke pasur parasysh madhësinë e madhe të lncARN-së (768 nukleotide), lidhja e DARS-AS1 me D3 mund të pengojë fizikisht ndërveprimin midis domenit PACT të dsRBD dhe PKR, duke bllokuar kështu lidhjen e PACT dhe PKR.Mutacionet e pikës PACT që zëvendësuan Ser246 dhe Ser287 në D3 me alaninë ose aspartat prishën afinitetin e tij lidhës për DARS-AS1, duke treguar rëndësinë e vetive të përgjithshme strukturore dhe elektrike të D3 në lidhjen e tyre.Detaje të mëtejshme të këtij mekanizmi do të kërkohen në të ardhmen, duke përdorur analiza më precize biokimike dhe analiza strukturore PACT me rezolucion të lartë.
Studimet e mëparshme kanë raportuar se DARS-AS1 promovon përhapjen e qelizave nëpërmjet disa mekanizmave51,52,53.Në një shembull, hetuesit vunë re se DARS-AS1 rregulloi gjenin e tij antisens që kodon proteinat DARS duke synuar miP-194-5p në qelizat e kancerit të veshkave.Sidoqoftë, në studimin aktual, rënia e DARS-AS1 kishte pak efekt në transkriptimin e DARS në lloje të shumta të kancerit, duke përfshirë të paktën kancerin kolorektal, gjirit dhe mëlçisë.Për shkak se lncARN-të shfaqin modele shprehjeje specifike për qelizat dhe indet, mekanizmat funksionalë mund të mos ruhen në të gjithë llojet e kancerit, gjë që mund të kontribuojë në këtë mospërputhje midis vëzhgimeve tona dhe vlerësimeve të mëparshme të kancereve të ndryshëm.Nevojiten studime të veçanta për të sqaruar mekanizmat specifikë të proceseve të ndryshme fiziologjike dhe patologjike.
Një analizë e të dhënave klinike tregoi se shprehja e DARS-AS1 në tumore është në korrelacion të kundërt me mbijetesën e pacientëve me kancer, gjë që nënvizon rëndësinë e boshtit DARS-AS1/PACT/PKR në prognozën e kancerit.Si përfundim, studimi ynë tregon se DARS-AS1 është një rregullator i boshtit sinjalizues PACT/PKR, promovon përhapjen e qelizave kancerogjene dhe frenon apoptozën gjatë përgjigjes ndaj stresit, e cila ofron një linjë tjetër kërkimi dhe është me interes për kërkimet e ardhshme në trajtimet e mundshme. .
Linjat e qelizave njerëzore SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 dhe HEK293T u morën nga Infrastruktura Kombëtare e Burimeve të Linjës Qelizore në Kinë.Të gjitha qelizat u mbajtën në mjedis DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) të plotësuar me 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) dhe 1% penicilinë-streptomicinë (Thermo Fisher Scientific) në 37°C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flamuri, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);IgG normale të miut, CST (5415S);IgG normale të lepurit, CST (2729S).Antitrupat u holluan 1:1000 në PBST për Western blotting dhe 1:100 për IP.
sgARN-të u zhvilluan duke përdorur një mjet publik të quajtur CRISPR-ERA66.Ne përdorëm parametrat e parazgjedhur të mjetit për zhvillimin e sgRNA dhe algoritmin e llogaritur vendet e lidhjes së sgRNA në rajonin 3 kb.me qendër në TSS.Grupet e oligonukleotideve të sgRNA u sintetizuan në CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) dhe u klonuan në plazmide të humanizuara të pgRNA (Addgene #44248).Një total prej 12 μg plazmidi të kombinuar të pgRNA të humanizuar, 7,2 μg psPAX2 (Addgene #12260) dhe 4,8 μg pMD2.G (Addgene #12259) u bashkëtransfektuan në 5 x 106 HEK293T në 10 cm difekte të ADN-së. qelizat (CWBIO, Pekin, Kinë) duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit.Supernatantët që përmbajnë virus u mblodhën 48 dhe 72 orë pas transfektimit dhe u filtruan përmes një filtri 0.45 μm.Për shqyrtimin, qelizat SW620 që shprehin proteinën e bashkimit dCas9/KRAB u morën nga transduksioni i virusit.Qelizat SW620 të modifikuara u infektuan me bibliotekën e virusit në katër eksperimente të pavarura të infeksionit në një MOI prej 0.1-0.3 dhe u morën kampione me 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) për 2 ditë.Më pas, qelizat u kultivuan për 18 ditë in vitro me një mbulim minimal bibliotekar prej 500 qeliza/sgARN për shqyrtim.
ADN-ja gjenomike u nxor sipas udhëzimeve të Kit QIAamp DNA Blood Midi (QIAGEN, Düsseldorf, Gjermani; 51183).Në total, 100 μg ADN gjenomike për përsëritje biologjike u përdorën për ndërtimin e bibliotekës.Rajoni i sgRNA u përforcua me dy raunde PCR dhe u lidh me një barkod.
Produktet PCR u pastruan duke përdorur xhelin NucleoSpin® dhe çantën e pastrimit PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Gjermani; 740609.250) dhe u përcaktuan në sasi duke përdorur çantën e zbulimit të ADN-së me dy zinxhirë Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Analiza MTS u përdor për të matur proliferimin e qelizave.Qelizat u mbollën në pllaka 96 pusesh me një densitet fillestar prej 2000 qeliza/pus.Numri relativ i qelizave matej çdo ditë në kohën e treguar për një total prej 4-6 ditësh.Për çdo pus, 20 μl reagent MTS (Promega) u hollua me 100 μl DMEM, u inkubua me qeliza për 4 orë në 37°C dhe më pas u mat OD490.
Kapaciteti për rritje të paankoruar u zbulua duke analizuar formimin e sferave.Shkurtimisht, 2000 qeliza të transfektuara me shRNA DARS-AS1 ose shRNA kontrolli u kultivuan në mikropllaka me ngjitje ultra të ulët (Corning) me ndryshim mesatar çdo 4 ditë.Sferoidet u numëruan pas 14 ditësh.500 qeliza të transfektuara me plazmidin e mbishprehjes DARS-AS1 ose një plazmid kontrolli u përdorën për analizën e përmirësimit, përndryshe metoda ishte e pandryshuar.
ARN u transkriptua duke përdorur T7 ARN polimerazën dhe biotin-16-UTP (Roche 1138908910) sipas udhëzimeve të Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Primerët e përdorur këtu janë renditur në Tabelën Suplementare 4.
Rajonet PACT ose PKR koduese të proteinave u klonuan në pET15b (Addgene #73619) dhe u transformuan në BL21 (DE3).Bakteret u inkubuan brenda natës në LB të furnizuar me ampicilinë dhe më pas u holluan 100-fish me LB të freskët.Kur OD600 e mediumit arriti në 0.8, u shtua 1 mM IPTG për të nxitur shprehjen e proteinave.Pas inkubimit gjatë natës me lëkundje të butë (250 rpm në 20°C), peleti i qelizave u mblodh me centrifugim (4000 rpm, 10 min, 4°C).Risuspendoni peletin qelizor në tampon lize (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) dhe inkuboni në akull për 30 minuta, më pas sonikoni (15 min, 5 s ndezur/fikur, në akull) dhe centrifugoni (13,000 rpm)., 30 min, 4°С).Supernatanti u ngarkua më pas në rrëshirë Ni-NTA (QIAGEN) 3 herë në 4°C, u la 4 herë me tampon larës (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) dhe u eluat 3 herë, me një total prej 10 ml tampon eluenti (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Proteina e pastruar u përcaktua duke përdorur WB dhe përqendrimi u përcaktua duke përdorur kompletin e analizës së proteinës Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Analizat RIP u kryen siç u përshkrua më parë, me modifikime.Shkurtimisht, 1x tampon RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, frenues i ribonukleazës RNasin (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteazë) liza kostatike71 xcyto (Roche, 1 mM DTT) dhe centrifugojini në 13,000 rpm për 15 minuta në 4 °C.Më pas, supernatanti u inkubua me rruaza magnetike të proteinës A+G (Millipore) të konjuguara me 5 μg antitrupi anti-PACT (Abeam) ose IgG (CST).Rruazat u lanë 5 herë me tampon 5x RIP, më pas u tretën me proteinazë K (NEB).ARN u ekstraktua me Trizol dhe u përcaktua me RT-qPCR.Primerat janë paraqitur në tabelën plotësuese 5.
Analiza in vitro RIP u krye sipas një protokolli standard të modifikuar të analizës RIP.Një total prej 5 pmol e ARN-së in vitro të transkriptuar u hollua 1x me tampon RIP dhe u pjek me inkubacion në 65°C për 5 minuta e ndjekur nga ftohje e ngadaltë në temperaturën e dhomës.Një total prej 5 pmol proteinash PACT të paprekura ose të mutuara të etiketuara me flamur u pastruan nga E. coli.Inkuboni me ARN të rinatyruar për 2 orë në 4°C dhe ndiqni procedurën e mësipërme për analizën RIP për IP kundër flamurit.
Për analizën e shtrirjes së ARN-së, qelizat 1×107 u lizuan me tampon 1xRIP.Pas centrifugimit në 13,000 rpm për 15 minuta në 4°C, supernatanti u trajtua paraprakisht me 30 μl rruaza magnetike streptavidine (Beckman) për 2 orë në 4°C.Lizati i pastruar u furnizua më pas me tRNA majaje dhe u inkubua me 40 pmol ARN të rikthyer gjatë natës në 4°C, më pas për 2 orë të tjera dhe u shtuan 20 μl rruaza të reja magnetike streptavidine të bllokuara me BSA.Hapi i larjes përbëhej nga 4 herë me bufer 5x RIP dhe 4 herë me 1x RIP bufer.Proteinat përkatëse u eluan me tampon elucioni biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotinë, PMSF) dhe u ndanë në NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Pas ngjyrosjes së argjendit (Beyotime Biotechnology), shirita të caktuar u prenë dhe u analizuan nga MS.
Analiza Co-IP u krye për të testuar ndërveprimin midis PACT dhe PKR.Shkurtimisht, lizatet supernatante u përgatitën duke inkubuar 1 x 107 qeliza të lizuara në 1 x tampon RIP të ndjekur nga centrifugimi në 13,000 rpm për 15 minuta në 4°C.Lizat u ngarkuan me rruaza magnetike të proteinës A + G, të konjuguara me 5 μg antitrupi anti-PACT dhe u rrotulluan butësisht gjatë natës në 4°C.Rruazat u lanë 3 herë me tampon 5×RIP, dy herë me bufer 1×RIP dhe u eluan me bufer 1×SDS.Proteina e rikuperuar u analizua me xhel SDS-PAGE dhe u zbulua nga WB.
Dy pmol PACT të shënuar dhe 1 pmol PKR u pastruan nga E. coli.Hollohet në tampon 1× RIP dhe inkubohet me 10 pmol ARN të rikthyer për 2 orë në 4 °C.Pas kësaj, ata u inkubuan me antitrupa anti-etiketuar të konjuguar me rruaza magnetike të proteinës A+G për dy orë të tjera.Rruazat më pas u lanë katër herë me 1x tampon RIP dhe u eluan me 1x bufer SDS.PACT dhe PKR që rezultuan u zbuluan nga BB.